CD9-Antigen (CD9)-Antikörper

Mindestens 17 Säugetier-Tetraspanin-Proteine wurden identifiziert, die jeweils vier hochgradig homologe Transmembrandomänen und kurze intrazelluläre N- und C-Termini enthalten. Die Proteine sind durch das Vorhandensein einer großen extrazellulären Domäne gekennzeichnet, die eine große Aminosäurediversität zeigt, mit Ausnahme von vier hoch konservierten Cysteinresten, von denen vorhergesagt wird, dass sie an Disulfidbindungen beteiligt sind.

Die konservierte Natur der Transmembran- und intrazellulären Regionen weist darauf hin, dass Tetraspanin-Proteine mit einem begrenzten Bereich von intrazellulären Komponenten interagieren.

Im Gegensatz dazu legen die abweichenden extrazellulären Domänensequenzen nahe, dass die extrazellulären Wechselwirkungen wahrscheinlich komplexer sein werden, mit unterschiedlichen Liganden für jedes Tetraspanin-Protein. 1
Die Beteiligung von Tetraspanin an der Zellfunktion ist vielfältig und umfasst Adhäsion, Zell-Zell-Kontakt und -Motilität, Fc-Rezeptor-Signalgebung und Virusanfälligkeit.
Immunpräzipitationsexperimente haben gezeigt, dass mehrere Arten von Proteinen mit Tetraspaninen zu assoziieren scheinen, was zu Vorschlägen für ein Membrannetzwerk führt, in dem Tetraspaninproteine eine weitgehend strukturelle Funktion ausüben und korrekte räumliche Beziehungen zwischen Proteinen aufrechterhalten. 2 Andere Daten deuten darauf hin, dass Tetraspanine eine Rolle bei der Signalübertragung spielen könnten, indem sie mit Protein- und Lipidkinasen und Phosphatasen interagieren [überprüft in den Referenzen 1, 3 und 4].
Das am intensivsten untersuchte Tetraspanin, CD9, wird auf einer Vielzahl von Zellen exprimiert (einschließlich B-Lymphoblasten, T-Zellen, Kolonkarzinom und Endothelzellen), und von vielen dieser Zelltypen sind funktionelle Daten verfügbar. 5-11 Mehrere monoklonale Antikörper (mAb) gegen CD9 induzieren die Blutplättchenaggregation und die Granulafreisetzung, die von FcγRIIa abhängig ist, obwohl sich das erzeugte Signal von der FcγRIIa-Aktivierung allein unterscheidet. 12
Bei Eosinophilen kann eine Reihe löslicher Anti-CD9-mAbs das zelluläre Überleben verlängern, indem sie die Produktion des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) erhöhen. Diese stimulierende Aktivität wird durch einen Anti-β2-Integrin-mAb gehemmt. 13

Die basophile Leukämie-Zelllinie der Ratte (RBL-2H3) ist eine weit verbreitete Modellzelllinie für die Signalübertragung über den hochaffinen Rezeptor für Immunglobulin E (IgE) (FcεRI). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Anti-Ratten-CD63- und -CD81-mAbs in der Lage sind, die IgE-vermittelte Sekretion 14, 15 in RBL-Zellen zu hemmen. Im Gegensatz dazu haben wir zuvor gezeigt, dass menschliches CD63 in der Lage ist, eine mAb-abhängige Sekretion zu vermitteln, wenn es in RBL-Zellen transfiziert wird. 16 In diesem Bericht haben wir die Ratten-CD9-negative RBL-Zelllinie verwendet, um die Beteiligung von menschlichem CD9 an der sekretorischen Antwort zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Anti-Human-CD9-Antikörper vom Isotyp Immunglobulin G1 (IgG1) transfizierte RBL-Zellen aktivieren, wahrscheinlich durch FcεRI. Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass ein Tetraspanin mit FcεRI kopräzipitieren kann, und diskutierten mögliche Wirkmechanismen für Antitetraspanin-mAbs auf RBL-Zellen.

Materialen und Methoden

Antikörper
Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierter Anti-CD9-Antikörper und ALB6-Anti-CD9-IgG1 wurden von Coulter (München, Deutschland) bezogen. Anti-CD63 mAb H5C6 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) erhalten. Die ALMA-Anti-CD9-mAbs wurden aus mit menschlichen Blutplättchen immunisierten Mäusen erzeugt, wie zuvor beschrieben. 17 Die Anti-CD9-Antikörper erkannten benachbarte oder identische Epitope auf der großen extrazellulären Domäne von CD9. 17

Gewebekultur
Basophile Rattenleukämiezellen (RBL-2H3) wurden routinemäßig in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10 % (v/v) fötalem Kälberserum (FCS) bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 10 % CO2 kultiviert. Medien für transfizierte Zellen wurden mit 400 mg/l G-418 für Transfektanten ergänzt. Transfizierte und untransfizierte RBL-Zellen wurden mit nicht-enzymatischer Zelldissoziationslösung geerntet.

Expression von humanem CD9 in RBL-Zellen
RBL-2H3-Zellen wurden durch Elektroporation transfiziert, wie zuvor beschrieben, 16 unter Verwendung des pEE6hCMV.neo-Vektors, der das Human-CD9-cDNA-Insert enthielt. Die Zellen wurden unter Verwendung von FITC-markiertem Anti-CD9 auf einem Becton-Dickinson Vantage FACsort (Becton Dickinson, Franklin, NJ) sortiert, wobei die besten 10 % bei zwei Gelegenheiten ausgewählt wurden. Nach der zweiten Sortierrunde wurde die Rezeptorzahl mit dem Quantum „Simply Cellular“-Kit (Sigma, Poole, Dorset, UK) quantifiziert.

F(ab′)2-Generation
Einzelne Peaks von IgG-Antikörpern wurden aus Aszitesflüssigkeit oder Kulturüberstand unter Verwendung von Protein G-Sepharose isoliert. Die Pepsin-Verdauung wurde dann bei 37°C für 10 h durchgeführt, mit einer endgültigen Enzymkonzentration von 25 mg/l. Die Vollständigkeit der Verdauung wurde durch Silberfärbung von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE)-Gelen überprüft. Die Reaktionen wurden dann mit 3 m Tris (pH 8,6) gequencht und bei 10 000 g zentrifugiert. Intakter Antikörper wurde durch Inkubation mit modifiziertem Protein G-Sepharose über Nacht entfernt.

Messung der Zellaktivierung
Verwendung von löslichem Anti-CD9-mAb. Dies wurde als Freisetzung von [3H]5-Hydroxytryptamin (5-HT) aus intrazellulären Granula als Reaktion auf eine 30-minütige Inkubation mit mAbs, wie zuvor beschrieben, bestimmt. 16 In einigen Fällen wurden die Zellen entweder mit IgE oder IgG1 und Anti-CD9-mAb co-inkubiert. mAbs wurden vor der Verwendung immer bei 100 000 g für 1 h zentrifugiert, um Aggregate zu entfernen. Alle Freisetzungswerte sind als Prozentsatz der gesamten zellassoziierten Radioaktivität angegeben, angepasst an die (spontane) Hintergrundfreisetzung oder als Prozentsatz der maximalen Antikörper-stimulierten Freisetzung. Die durch Anti-CD9-mAb stimulierte Sekretion betrug typischerweise 50–75 % der maximalen sekretorischen Reaktion auf die Quervernetzung von oberflächengebundenem mIgE durch optimale Antigenkonzentrationen.

Verwendung von Anti-CD9-mAb-beschichteten fixierten Zellen. In einigen Experimenten wurde die Fähigkeit von Anti-CD9-mAb-beschichteten fixierten Zellen, die Sekretion von nicht fixierten Zellen zu stimulieren, analysiert. Nach dem Ernten wurden die Zellen durch Inkubation mit 1 % (w/v) Paraformaldehyd in ausgewogener Salzlösung (BSS) für 30 min bei 4° fixiert. Nach zwei Waschgängen in BSS + 0,2 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung wurden die fixierten Zellen in BSS/BSA allein mit entweder ALMA 1 oder Isotyp-Kontroll-Ab bei 1 µg/2 × 105 Zellen (die Verhältnis, das im Antikörper-Dosis-Wirkungs-Assay die maximale Freisetzung ergibt). Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert und dann dreimal mit BSS gewaschen, um überschüssiges mAb zu entfernen. Die mAb-beschichteten fixierten Zellen wurden zu Monolayern lebender RBL-Zellen gegeben, die mit [3H]5HT vormarkiert waren, und für 30 min bei 37° inkubiert. Die Degranulationsreaktion der lebenden Zellen auf die mAb-beschichteten fixierten Zellen wurde wie oben beschrieben als Freisetzung von [³H]5HT in den Überstand bestimmt. Aliquots von fixierten Zellen wurden auch unter Verwendung von Durchflusszytometrie analysiert, um die mAb-Bindung zu bestimmen.
Immunpräzipitation von Fc-Rezeptoren und CD9
Menschliche CD9- und scheintransfizierte RBL-Zellen wurden über Nacht mit 1 µg/ml Dinitrophenol (DNP)-spezifischem Maus-IgE inkubiert und dann vor der Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten mit Freisetzungspuffer gewaschen, mit oder ohne 100 µg/ml DNP -humanes Serumalbumin (HSA). Nach zweimaligem Waschen mit Freisetzungspuffer und einmal mit Lysepuffer ohne Detergenz (50 m m Tris-HCl, pH 7,6, 100 m m NaCl, 5 m m EDTA, 5 m m NaF, 1 m m Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF], 1 m m Na3VO4 und 2 µg/ml Aprotinin, Pepstatin und Leupeptin) wurden die Zellen mit 1 % (v/v) (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-l-propansulfanat (CHAPS) in Lysepuffer bei 4° für 30 lysiert Min. Nach Zentrifugation bei 15 000 g (für 5 min bei 4°) wurden die Lysate dreimal mit Protein A-Agarose bei 4° für 1 h geklärt und dann mit unterschiedlichen Konzentrationen von Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper bei 4° für 2 inkubiert Std.

CD9 Antigen (CD9) Antibody
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CD9 Antigen (CD9) Antibody (Biotin)
abx341477-50l	Abbexa	50 µl	250 EUR
Anti-CD9 antigen CD9 Antibody
A01202	BosterBio	0.1mg	449 EUR
CD9 Antigen (CD9) Antibody (OC-515)
abx200083-100tests	Abbexa	100 tests	526.8 EUR
CD9 Antigen (CD9) Antibody (CF-Blue)
abx200082-100tests	Abbexa	100 tests	526.8 EUR
CD9 Antigen (CD9) Antibody (APC-C750)
abx200084-100tests	Abbexa	100 tests	1195.2 EUR
CD9 Antigen (CD9) Antibody (APC / Cyanine 7)
abx140916-100g	Abbexa	100 µg	437.5 EUR
Cd9 (untagged) - Mouse CD9 antigen (Cd9), (10ug)
MC208269	Origene Technologies GmbH	10 µg	Ask for price
CD9 Antigen (CD9) Rabbit anti-Human Polyclonal Antibody
GWB-648875	GenWay Biotech	0.05 mg	Ask for price
Human CD9 Antigen (CD9) Protein
abx168683-1ml	Abbexa	1 ml	225 EUR
Human CD9 Antigen (CD9) Protein
abx680387-20g	Abbexa	20 µg	225 EUR
Human CD9 Antigen (CD9) Protein
abx680387-50g	Abbexa	50 µg	325 EUR
Recombinant Cat CD9 antigen (CD9)
MBS7011192-002mg	MyBiosource	0.02mg	1515 EUR
Recombinant Cat CD9 antigen (CD9)
MBS7011192-01mg	MyBiosource	0.1mg	2475 EUR
Recombinant Cat CD9 antigen (CD9)
MBS7011192-5x01mg	MyBiosource	5x0.1mg	11105 EUR
Recombinant Pig CD9 antigen (CD9)
MBS7011195-002mg	MyBiosource	0.02mg	1515 EUR
Recombinant Pig CD9 antigen (CD9)
MBS7011195-01mg	MyBiosource	0.1mg	2475 EUR
Recombinant Pig CD9 antigen (CD9)
MBS7011195-5x01mg	MyBiosource	5x0.1mg	11105 EUR
Recombinant Rat CD9 antigen (Cd9)
MBS7011196-002mg	MyBiosource	0.02mg	1515 EUR
Recombinant Rat CD9 antigen (Cd9)
MBS7011196-01mg	MyBiosource	0.1mg	2475 EUR
Recombinant Rat CD9 antigen (Cd9)
MBS7011196-5x01mg	MyBiosource	5x0.1mg	11105 EUR
Recombinant Cat CD9 antigen (CD9)
MBS948049-INQUIRE	MyBiosource	INQUIRE	Ask for price
Recombinant Rat CD9 antigen (Cd9)
MBS952629-INQUIRE	MyBiosource	INQUIRE	Ask for price
Recombinant Mouse CD9 antigen (Cd9)
CSB-CF004969MO	Cusabio	7697 mg	Ask for price
Recombinant Mouse CD9 antigen (Cd9)
RPC27434-100ug	Biomatik Corporation	100ug	3235.3 EUR
Recombinant Mouse CD9 antigen (Cd9)
RPC27434-20ug	Biomatik Corporation	20ug	2012.7 EUR
Recombinant Mouse CD9 antigen (Cd9)
MBS7011194-002mg	MyBiosource	0.02mg	1515 EUR

Immunkomplexe wurden durch Inkubation mit Protein A-Agarose-Kügelchen bei 4° für 1 h isoliert, dann dreimal mit Lysepuffer gewaschen, durch Kochen eluiert und durch 15 % SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen aufgelöst und anschließend auf Nitrocellulose übertragen Membranen wurden unter Verwendung von Anti-CD9-Antikörpern sondiert und dann unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz sichtbar gemacht.