• August 16, 2022

Vereinfachte Validierung des ELISA-Kits zur Bestimmung von Microcystinen in Oberflächengewässern

Der Enzymimmunoassay (ELISA) ist als universelle Methode zur Bestimmung von Microcystinen von großer Bedeutung für den schnellen Nachweis von Microcystin-Belastungen. Ziel dieser Studie war es, eine vereinfachte Validierungsmethode für Microcystins-ELISA-Kits vorzuschlagen, indem verwandte Dokumente und Richtlinien zusammengefasst wurden. Nach der Zusammenfassung und Klärung von 20 Validierungsparametern wurden 11 Parameter ausgewählt, um die Validierung des Microcystins-ELISA-Kits zu vereinfachen. Darüber hinaus wurden der akzeptable Bereich und die Validierungsdetails jedes Parameters analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das Bestimmtheitsmaß der Microcystin-LR-Standardkurve größer als 0,99 war.

Die Konzentration der Qualitätskontrollproben lag innerhalb der Kontrollgrenzen. Die Genauigkeit der aufgestockten und tauglichen Proben lag zwischen 70 % und 130 %. Die Variabilität der Intra-Assay-, Inter-Assay- und Reproduzierbarkeit betrug weniger als 11, 15 bzw. 21 %. Die LOD und LLOQ lagen bei 0,002 μg/L bzw. 0,05 μg/L. Wenn die Microcystinkonzentration 5 μg/L überstieg, wurde empfohlen, die Proben vor dem Nachweis auf den Arbeitsbereich zu verdünnen. Die Spezifität wurde mit sieben Microcystin-Analoga und drei Aminosäuren abgeschätzt, was darauf hindeutet, dass die Kreuzreaktivität weniger als 30 % betrug. Diese Ergebnisse zeigten, dass der ELISA-Kit für den Nachweis von Microcystinen in Wasser zufriedenstellend war.

Kann Procalcitonin in Rindermilch mit einem kommerziellen ELISA-Kit nachgewiesen werden?

Ziel war es, die Verwendung eines Rinder-Procalcitonin (PCT)-ELISA-Kits  Contact Gentaur (Cusabio, China) für die Bestimmung von PCT in Rindermilchproben zu bewerten. Die Validierung erfolgte anhand von 10 Plasma- und entsprechenden Milchproben von mastitischen Kühen. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde berechnet. Der Variationskoeffizient (CV%) der Messwerte von fünf Plasmaproben, die fünfmal in derselben Platte gemessen wurden (Intra-Assay), und der CV% der gleichen fünf Proben, die fünfmal in drei separaten Platten gemessen wurden, wurde ausgewertet. Die Parallelität wurde durch serielle Zweifachverdünnungen von fünf Plasma- und entsprechenden Milchproben bestimmt. Die Milchproben wurden mit und ohne Zentrifugation analysiert.

Für Plasma-PCT wies die Methode einen inter- und intra-CV < 23,7 % auf, und die Parallelität hatte sehr gute Wiederfindungswerte. Mit dem untersuchten ELISA-Kit können PCT-Konzentrationen im Rinderplasma gemessen werden. Die Antikörper des Kits können PCT in Milchproben nicht binden, da alle zentrifugierten Milchproben eine niedrigere LOD als Leerproben aufwiesen. Nur drei nicht zentrifugierte Milchproben wiesen messbare PCT-Konzentrationen auf. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte der untersuchte kommerzielle ELISA-Kit nicht für den Nachweis von PCT in Milchproben eingesetzt werden.

Quantifizierung von Gerstenkontaminanten in glutenfreiem Hafer mit vier Gluten-ELISA-Kits

Reiner Hafer gilt allgemein als unbedenklich für die meisten Zöliakiepatienten, und der Verzehr von Hafer liefert vorteilhafte Ballaststoffe. Allerdings kann Hafer durch Glutenproteine aus Weizen, Gerste und/oder Roggen verunreinigt sein. Die analytische Herausforderung liegt in der Zuverlässigkeit der Quantifizierungsmethode und in der Frage, wie der Kontaminationsgrad unter dem Grenzwert für glutenfreie Lebensmittel von 20 mg/kg gehalten werden kann. In dieser Studie untersuchten wir mit Gerste versetzte Hafermehlproben auf vier Ebenen mit vier Gluten-ELISA-Kits. Die größte Abweichung bei der Wiederfindung ergab sich beim R5-Kit, das eine 5-6-fache Überschätzung ergab; der G12-Kit reagierte mit Haferproteinen und ergab eine 4-5-fache Überschätzung bei allen gespikten Werten.

Die Kits Total Gluten und Morinaga ergaben zufriedenstellende Wiederfindungen. Die gesamten Gerstenhordeine wurden isoliert und charakterisiert, um als gemeinsamer Kalibrator für alle vier Kits verwendet zu werden, um die Ergebnisse zu harmonisieren und die Leistungsfähigkeit der Kits zu testen. Immunoblotting des gesamten Hordeinisolats ergab, dass die Antikörper Total Gluten und Morinaga einen Gesamtnachweis erbrachten, während die Antikörper R5 und G12 spezifische Hordeingruppen erkannten, was zu einem größeren Unterschied führte, wenn Weizen und Gerste als Kalibriermittel verwendet wurden. Die Kalibrierung mit Gesamt-Hordein-Isolat korrigierte das Problem der Überschätzung und verringerte die Variabilität zwischen den vier Gluten-Kits.

Bewertung eines gattungsspezifischen rGroEL 1-524 IgM-ELISA und kommerzieller ELISA-Kits im Verlauf der Leptospirose in Thailand

In der vorliegenden Studie entwickelten wir einen gattungsspezifischen rGroEL1-524 IgM-ELISA-Assay zur Verwendung in der Screening-Diagnose bei Verdacht auf Leptospirose bei Patienten mit akuten undifferenzierten fiebrigen Erkrankungen während des akuten Fiebers. Die diagnostische Genauigkeit des rGroEL1-524 IgM-ELISA, des kommerziellen Panbio IgM-ELISA und des Virion-Serion Classic IgG-ELISA wurde anhand von 133 thailändischen Leptospirose-Seren und 210 Kontrollen bewertet. Die Sensitivitäten lagen bei 91,7 %, 59,6 % und 17,7 % für die akute Infektion und die Spezifitäten bei 92,6 %, 90,2 % bzw. 88,3 % für die Nicht-Leptospirose-Kontrolle. Der rGroEL1-524 IgM-ELISA hatte eine hohe Sensitivität von 92,3 % bzw. 91,7 % bei kulturpositiven und MAT-negativen Fällen 1-3 Tage nach Auftreten der Symptome (DPO1-3). Beeinträchtigte Spezifität bei Scrub-Type.

Entwicklung eines humanen Toxo-IgG-ELISA-Kits und Falsch-Positivität des Latex-Agglutinationstests für die Diagnose von Toxoplasmose

Toxoplasma gondii ist ein intrazellulärer zoonotischer Parasit, der Infektionen bei einer Vielzahl von Warmblütern und Menschen verursacht. Das Hauptziel dieser Studie bestand darin, den diagnostischen Wert des rekombinanten SAG1-Antigens (rSAG1) für das T. gondi-IgG-Screening mit dem Human Toxo IgG ELISA Kit (K) zu bewerten. Das rSAG1 wurde in E. coli (DE3) exprimiert und durch Metall-Affinitätschromatographie gereinigt. Das rSAG1 wurde durch Immunoblotting bestätigt und wies eine Bande von 35 kDa auf. Insgesamt wurden 400 Humanseren mit LAT und K getestet. Einhundertzweiundzwanzig (30,5 %) Seren wurden mit LAT und neunundachtzig (22,25 %) Seren mit K als positiv befunden.

Von den 400 Proben wurden 80 ausgewählt, um die Leistung von K mit einem kommerziellen Toxoplasma gondii IgG ELISA Kit (C) zu bewerten. Von den 80 Humanseren waren 55 (68,75 %) positiv und 25 (31,25 %) mit K bzw. C negativ. Der Cut-off-Wert für K lag bei 0,398 und wurde anhand der Receiver-Operator-Charakteristikkurve berechnet. Die ELISA-Platten wurden mit einer optimierten Konzentration von rSAG1 = 0,125 µg/ml beschichtet, und der Test wurde durch Verdünnung der Seren im Verhältnis 1:50 durchgeführt. Die Sensitivität und Spezifität von K wurde mit 98,5 % bzw. 100 % festgestellt. Die sechs Seren (K-L+) wurden durch LAT als positiv befunden, und diese Humanseren wurden später durch Western-Blot-Analyse bewertet. Diese Seren wiesen bei der WB-Analyse keine Bande von 35 kDa auf, so dass die LAT falsch-positive Ergebnisse lieferte.

Serodiagnostische Wirksamkeit verschiedener ELISA-Kits zur Diagnose der infektiösen bovinen Rhinotracheitis (IBR) bei Rindern und Büffeln in Indien

Das Bovine Alphaherpesvirus-1 (BoHV-1), der Erreger der infektiösen bovinen Rhinotracheitis (IBR), ist ein wirtschaftlich wichtiger viraler Krankheitserreger, der Rinder und Büffel befällt. Für den Nachweis der Antikörper werden meist serologische Tests verwendet, doch wurden Unterschiede in der diagnostischen Leistungsfähigkeit der einzelnen Tests festgestellt. In der vorliegenden Studie wurden vier im Handel erhältliche ELISA-Kits {zwei indirekte ELISA (Kits A und B) und zwei blockierende ELISA (Kits C und D)} für den Nachweis von Antikörpern gegen BoHV-1 bei indischen Rindern und Büffeln (Zweckmäßigkeit) bewertet. Die diagnostische Sensitivität (dsn) und Spezifität (dsp) dieser Kits wurden auf drei Arten bestimmt: unter Berücksichtigung des Virusneutralisationstests (VNT) als Goldstandardtest, unter Verwendung von Vorabinformationen der Proben und der Mehrheit der Tests.

Das Screening von 200 bekannten negativen Seren (124 Rinder, 76 Büffel) aus IBR-freien Betrieben ergab, dass gB-basierte ELISA-Kits spezifischer sind als die indirekten ELISA-Kits. Die Untersuchung von 125 bekannten positiven Seren (81 Rinder, 44 Büffel) zeigt, dass Kit B am empfindlichsten ist, gefolgt von Kit C, A und D. Interessanterweise erwies sich Kit D als am empfindlichsten für den Nachweis von durch Impfung induzierten BoHV-1-Antikörpern, gefolgt von Kit B. Ein ähnlicher Trend wurde auch beim Verdünnungsgrenzenexperiment mit bekannten infizierten und geimpften Seren beobachtet.

Der VNT erwies sich als der spezifischste Test, und seine Verwendung als Goldstandard-Test ergab, dass alle Kits eine Sensitivität von mehr als 99 % aufwiesen. Mit allen ELISA-Kits konnten BoHV-1-spezifische Antikörper in den IBR-geimpften Kälbern bereits 11 Tage nach der Impfung nachgewiesen werden. In der Kappa-Statistik wurde eine nahezu perfekte Übereinstimmung zwischen den ELISA-Kits festgestellt. Die Gesamtleistung der Kits bei der Serodiagnose von IBR, ermittelt durch die Fläche unter der Kurve in der ROC-Analyse, war gut.

 

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