Polyklonaler Kaninchen-Anti-Phosphothreonin-Antikörper, Biotin
Einführung
Proteinkinasen übertragen Phosphatgruppen von ATP auf Serin-, Threonin- oder Tyrosinreste auf Proteinpeptidsubstraten, wodurch die Aktivität und Funktion des Ziels direkt beeinflusst werden. Studien mit radioaktiven Markierungen deuten darauf hin, dass etwa 30 % der Proteine in eukaryotischen Zellen einer Phosphorylierung unterliegen.1, 2 Diese entscheidende posttranslationale Modifikation reguliert ein breites Spektrum zellulärer Aktivitäten, einschließlich des Zellzyklus, der Differenzierung, des Stoffwechsels und der neuronalen Kommunikation.
Außerdem sind abnormale Phosphorylierungsereignisse an vielen Krankheitszuständen beteiligt. Bei der Bewertung der Phosphorylierung kann die Methode der Wahl in Abhängigkeit von vielen Faktoren variieren, einschließlich der spezifischen Fragestellung und der Verfügbarkeit von Spezialgeräten oder Reagenzien. Diese Übersicht enthält eine kurze Beschreibung mehrerer derzeit verwendeter Methoden und geht auf einige der damit verbundenen Vor- und Nachteile ein.
Kinase-Aktivitäts-Assays
Proteinkinasen sind häufig gemeinsame Elemente in mehreren Signalnetzwerken, die zahlreiche nachgeschaltete Effektoren beeinflussen, die für eine biologische Reaktion verantwortlich sind.
- Daher kann die Bestimmung der Aktivität einer einzelnen spezifischen Kinase wertvolle Informationen über parallele Wege liefern.3 Die Kinaseaktivität in einer biologischen Probe wird üblicherweise in vitro durch Inkubation der immunpräzipitierten Kinase mit einem exogenen Substrat in Gegenwart von ATP gemessen.
- Die Messung des phosphorylierten Substrats durch eine spezifische Kinase kann mit mehreren Reportersystemen bewertet werden, einschließlich kolorimetrischer (Abbildung 1), radioaktiver oder fluorometrischer Detektion.4 Darüber hinaus bietet R&D Systems ein nicht-radioaktives Universal Kinase Activity Kit an, das die Quantifizierung von Kinase ermöglicht Aktivität für jede Kinase, die ADP produziert.
- Obwohl Informationen über die Wirkungen einer bestimmten Kinase erhalten werden können, bietet die Bewertung der Enzymaktivität in Zellextrakten nur einen Einblick in die Signallandschaft. Über die modifizierten Proteine wird wenig offenbart, und In-vitro-Aktivitätsassays gehen nicht auf die Rolle einer potenziellen endogenen Phosphataseaktivität ein.
- Der direkte Nachweis von phosphorylierten Proteinen kann eine detailliertere Analyse der zellulären Reaktion auf einen externen Stimulus liefern, da die Identifizierung eines Phosphopeptids Informationen über die Expression und den funktionellen Zustand dieses Proteins liefert.
Phosphospezifische Antikörperentwicklung
Eine klassische Methode zur direkten Messung der Proteinphosphorylierung umfasst die Inkubation ganzer Zellen mit radioaktiv markiertem 32P-Orthophosphat, die Gewinnung von Zellextrakten, die Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE und die Belichtung mit Film.2, 5 Diese arbeitsintensive Methode erfordert viele Multi -Stunden-Inkubationen und die Verwendung von Radioisotopen. Andere traditionelle Methoden umfassen die zweidimensionale Gelelektrophorese, eine Technik, die davon ausgeht, dass die Phosphorylierung die Mobilität und den isoelektrischen Punkt des Proteins verändert.
- Angesichts dieser aufwändigen Methoden war die Entwicklung von phosphorylierungsabhängigen Antikörpern ein willkommenes Ereignis für die Forscher. 1981 wurde der erste dokumentierte Phospho-Antikörper in Kaninchen produziert, die mit Benzonylphosphonat, konjugiert an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), immunisiert wurden.
- Dieser Antikörper erkannte weitgehend Proteine, die Phosphotyrosin enthielten.6 Zehn Jahre später wurden Phosphorylierungsstatus-spezifische (Phospho-spezifische) Antikörper entwickelt, indem Kaninchen mit synthetischen Phosphopeptiden immunisiert wurden, die die Aminosäuresequenz darstellen, die die Phosphorylierungsstelle des Zielproteins umgibt.7
- Das Immunserum war auf eine Peptidaffinitätssäule aufgetragen, um ein hochspezifisches Immunreagens zu erzeugen. Die Verfügbarkeit von Phospho-spezifischen Antikörpern hat die Tür für die Verbesserung traditioneller Methoden sowie für die Entwicklung neuer Immunoassay-Techniken geöffnet (Phospho-spezifische Antikörper anzeigen).
- Der Hauptvorbehalt bei der Verwendung phosphospezifischer Antikörper in jeder Technik besteht darin, dass ein erfolgreicher Nachweis von der Spezifität und Affinität des Antikörpers für das interessierende Phosphoprotein abhängt.
Westlicher Fleck
Der Western Blot ist die gebräuchlichste Methode zur Bestimmung des Phosphorylierungszustands eines Proteins, und die meisten zellbiologischen Labors verfügen über die notwendige Ausrüstung, um diese Experimente durchzuführen. Nach Trennung der biologischen Probe mit SDS-PAGE und anschließender Übertragung auf eine Membran (normalerweise PVDF oder Nitrocellulose) kann ein phosphospezifischer Antikörper verwendet werden, um das interessierende Protein zu identifizieren (Phospho-spezifische Antikörper für die Western-Blot-Analyse anzeigen). Das typische Western-Blot-Protokoll eliminiert die Gefahren und Abfallentsorgungsanforderungen, die mit der Verwendung von Radioisotopen verbunden sind. Viele Phospho-spezifische Antikörper sind ziemlich empfindlich und können das phosphorylierte Protein in einer Routineprobe (z. B. 10–30 &mgr;g Ganzzellextrakt) leicht nachweisen. Da sich die gemessenen Spiegel eines Phosphoproteins mit der Behandlung oder durch Gelladefehler ändern können, verwenden Forscher oft einen Antikörper, der den Gesamtspiegel des verwandten Proteins (unabhängig vom Phosphorylierungszustand) nachweist, um den phosphorylierten Anteil im Verhältnis zum Gesamtanteil zu bestimmen und als interne Ladekontrolle dienen . Sowohl Chemilumineszenz- als auch kolorimetrische Nachweisverfahren sind üblich, und Molekulargewichtsmarker werden im Allgemeinen auch verwendet, um Informationen über die Proteinmasse bereitzustellen.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Der ELISA ist zu einer leistungsfähigen Methode zur Messung der Proteinphosphorylierung geworden. ELISAs sind quantitativer als Western Blotting und zeigen einen großen Nutzen in Studien, die Kinaseaktivität und -funktion modulieren. Das Format für diesen auf Mikroplatten basierenden Assay verwendet typischerweise einen für das gewünschte Protein spezifischen Einfangantikörper, unabhängig vom Phosphorylierungszustand. Das Zielprotein, entweder gereinigt oder als Komponente in einer komplexen heterogenen Probe wie einem Zelllysat, wird dann an die Antikörper-beschichtete Platte gebunden. Anschließend wird ein für die zu analysierende Phosphorylierungsstelle spezifischer Nachweisantikörper zugegeben. Diese Assays werden typischerweise unter Verwendung einer kolorimetrischen oder fluorometrischen Detektion entwickelt. Die Intensität des resultierenden Signals ist direkt proportional zur Konzentration des in der ursprünglichen Probe vorhandenen phosphorylierten Proteins (Abbildung 3). Die Phospho-spezifische ELISA-Technik verleiht mehrere Vorteile gegenüber dem traditionelleren Immunoblotting bei der Messung der Proteinphosphorylierung. Erstens sind die Ergebnisse leicht quantifizierbar, indem ein kalibrierter Standard verwendet wird. Zweitens ist eine hohe Spezifität aufgrund der Verwendung von zwei für das Zielprotein spezifischen Antikörpern möglich, die gemeinsam im Sandwich-Format verwendet werden. Drittens ermöglicht die durch ELISAs oft erzielte höhere Empfindlichkeit kleinere Probenvolumina und den Nachweis von Proteinen mit geringer Häufigkeit.
Rabbit Anti Phosphothreonine Polyclonal Antibody,Biotin |
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Rabbit Anti Phosphothreonine Polyclonal Antibody |
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Rabbit Anti Phosphothreonine Polyclonal Antibody,HRP |
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Phosphothreonine Antibody (Biotin) |
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Phosphothreonine antibody (biotin) |
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Phosphothreonine [T252] aurora kinase B (AURKB) polyclonal antibody |
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Phosphothreonine Antibody |
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Phosphothreonine antibody |
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Phosphothreonine antibody |
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Phosphothreonine Antibody |
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Phosphothreonine Antibody (APC) |
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Phosphothreonine Antibody (RPE) |
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Phosphothreonine Antibody (HRP) |
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Antibody for Phosphothreonine |
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Phosphothreonine Antibody (FITC) |
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Phosphothreonine Antibody (PerCP) |
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Phosphothreonine-Pro antibody |
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Phosphothreonine Antibody (ATTO 390) |
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Phosphothreonine Antibody (ATTO 488) |
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Phosphothreonine Antibody (ATTO 565) |
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Phosphothreonine Antibody (ATTO 594) |
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Phosphothreonine Antibody (ATTO 633) |
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Phosphothreonine Antibody (ATTO 680) |
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Phosphothreonine Antibody (ATTO 700) |
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Phosphothreonine Antibody (PE / ATTO 594) |
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Phosphothreonine Antibody (Streptavidin) |
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Phospho-threonine [T497] PKCalpha (PRKCA) polyclonal antibody |
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Phosphoserine and Phosphothreonine antibody |
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| 70R-10686 | Fitzgerald | 1 ml | 447.6 EUR |
Phospho-threonine [T198] PKACbeta (PRKACB) polyclonal antibody |
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| ABP-PAB-11662 | Allele Biotech | 100 ug | Ask for price |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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| SMC-158D-APCCY7 | Stressmarq | 0.1ml | 528 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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| SMC-158D-DY594 | Stressmarq | 0.1ml | 435.6 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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| SMC-158D-HRP | Stressmarq | 0.1ml | 428.4 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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| SMC-158D-RPE | Stressmarq | 0.1ml | 438 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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Phosphothreonine Antibody (Alkaline Phosphatase) |
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| abx448352-400ul | Abbexa | 400 ul | 693.6 EUR |
Phospho-threonine [T288] serine/threonine kinase 6 (STK6) polyclonal antibody |
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Phospho-threonine [T258] protein kinase interferon-inducible double stranded RNA dependent (PRKR) polyclonal antibody |
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| ABP-PAB-11664 | Allele Biotech | 100 ug | Ask for price |
Phospho-threonine [T414] protein kinase interferon-inducible double stranded RNA dependent (Prkr) polyclonal antibody |
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| ABP-PAB-11666 | Allele Biotech | 100 ug | Ask for price |
Phosphothreonine-BSA conjugate (blocking antigen) for ELISA, Western |
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| PTHR15-N | Alpha Diagnostics | 100 ug | 270 EUR |
Rabbit Anti Phosphoserine Polyclonal Antibody,Biotin |
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| DPBT-68212RP | Creative Diagnostics | 50 µg | 1057.2 EUR |
Rabbit Anti-Human MAPT Polyclonal Antibody, Phospho-Thr212 |
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| CPB-788RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human MAPT Polyclonal Antibody, Phospho-Thr181 |
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Rabbit Anti-Human MAPT Polyclonal Antibody, Phospho-Thr205 |
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Rabbit Anti-Human MAPT Polyclonal Antibody, Phospho-Thr231 |
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| CPB-672RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human CDK2 Polyclonal Antibody, Phospho-Thr160 |
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| CPB-693RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 534 EUR |
Rabbit Anti-Human CDK1 Polyclonal Antibody, Phospho-Thr161 |
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| CPB-694RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 534 EUR |
Rabbit Anti-Human PAK1 Polyclonal Antibody, Phospho-Thr212 |
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| CPB-710RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human RELA Polyclonal Antibody, Phospho-Thr505 |
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| CPB-719RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human EGFR Polyclonal Antibody, Phospho-Thr678 |
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| CPB-734RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human TP53 Polyclonal Antibody, Phospho-Thr18 |
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| CPB-657RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human CHUK Polyclonal Antibody, Phospho-Thr23 |
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| CPB-689RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 534 EUR |
Rabbit Anti-Human MAPK1 Polyclonal Antibody, Phospho-Thr180 |
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| CPB-783RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human SMAD2 Polyclonal Antibody, Phospho-Thr220 |
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| CPB-835RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human AURKA Polyclonal Antibody, Phospho-Thr288 |
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| CPB-853RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human PRKCB Polyclonal Antibody, Phospho-Thr641 |
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| CPB-1260RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 670.8 EUR |
Rabbit Anti-Human LIMK1 Polyclonal Antibody, Phospho-Thr508 |
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| CPB-686RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 534 EUR |
Rabbit Anti-Human LIMK2 Polyclonal Antibody, Phospho-Thr505 |
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| CPB-687RH | Creative Diagnostics | 100 ul | 534 EUR |
Schließlich ermöglicht das Mikroplatten-basierte Format einen viel höheren Durchsatz als herkömmliches Western Blotting (View Surveyor IC ELISA Kits). ELISAs liefern im Allgemeinen eine indirekte Messung der Kinaseaktivität. Variationen der oben beschriebenen Technik verwenden jedoch einen immobilisierten Capture-Antikörper, ein Substrat und ein Phospho-Substrat-Nachweisverfahren für direktere Messungen der Kinase-Aktivität.