• Mai 22, 2022

Kit zur direkten Maus-Genotypisierung

Abstrakt
Der direkte PCR-Ansatz erleichtert die PCR-Amplifikation direkt aus kleinen Mengen ungereinigter Proben und wird hier für mehrere pflanzliche und tierische Gewebe demonstriert. Die direkte PCR basiert auf speziell entwickelten Phusion- und Phire-DNA-Polymerasen von Thermo Scientific, die eine doppelsträngige DNA-Bindungsdomäne enthalten, die ihnen einzigartige Eigenschaften wie eine hohe Toleranz gegenüber Inhibitoren verleiht.

Der PCR-basierte Ziel-DNA-Nachweis hat zahlreiche Anwendungen in der Pflanzenforschung, einschließlich der Analyse von Pflanzengenotypen und der Verifizierung von Transgenen.

Die PCR aus Pflanzengewebe beinhaltet traditionell einen anfänglichen DNA-Isolierungsschritt, der teure oder toxische Reagenzien erfordern kann. Der Prozess ist zeitaufwändig und erhöht das Risiko einer Kreuzkontamination1, 2.

  • Umgekehrt kann die Ziel-DNA mit dem Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit ohne vorherige DNA-Extraktion leicht nachgewiesen werden. In dem hier gezeigten Modell wird ein Beispiel für abgeleitete gespaltene amplifizierte polymorphe Sequenzanalysen (dCAPS)3,4 direkt an Arabidopsis-Pflanzenblättern durchgeführt. dCAPS-Genotypisierungsassays können verwendet werden, um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) durch SNP-Allel-spezifische Restriktionsendonuklease-Verdauung zu identifizieren3.
  • Einige Pflanzenproben sind bei der Verwendung von direkten PCR-Methoden tendenziell schwieriger, da sie Komponenten enthalten, die die PCR stören, wie z. B. phenolische Verbindungen.
  • In diesen Fällen ist traditionell ein zusätzlicher Schritt zur Entfernung der Verbindungen erforderlich2,5. Hier wird dieses Problem überwunden, indem ein schnelles und einfaches Verdünnungsprotokoll gefolgt von einer direkten PCR-Amplifikation verwendet wird. Fünfzehn Jahre alte Eichenblätter werden als Modell für herausfordernde Pflanzen verwendet, da das Exemplar hohe Mengen an phenolischen Verbindungen einschließlich Tanninen enthält.
  • Der Gentransfer in Mäuse wird allgemein verwendet, um die Rolle von Genen in der Entwicklung, Physiologie und menschlichen Krankheiten zu untersuchen. Die Verwendung dieser Tiere erfordert ein Screening auf das Vorhandensein des Transgens, üblicherweise mit PCR.
  • Traditionell beinhaltet dies einen zeitaufwändigen DNA-Isolierungsschritt, während dessen DNA für die PCR-Analyse aus Ohr-, Schwanz- oder Zehengewebe gereinigt wird6,7. Mit dem Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit können transgene Mäuse jedoch ohne vorherige DNA-Reinigung genotypisiert werden. In diesem Protokoll erfolgt die transgene Maus-Genotypisierung direkt aus Mausohrgeweben, wie hier für ein herausforderndes Beispiel gezeigt, bei dem nur ein Primersatz zur Amplifikation von zwei Fragmenten mit stark unterschiedlicher Größe verwendet wird.

Protokoll

1. Genotypisierung von Arabidopsis-Pflanzenindividuen mit direktem Protokoll

1Um mit dem dCAPS-Genotypisierungsassay direkt auf dem Blatt der Arabidopsis-Pflanze zu beginnen, formulieren Sie zuerst 20 oder 50 μl PCR-Reaktionen mit dem Phire Plant Direct PCR Kit .
2Schneiden Sie als Nächstes mit dem Harris Uni-Core und der Harris-Schneidmatte einen 0,50-mm-Stanzer aus einem Arabidopsis-Pflanzenblatt. Halten Sie den Puncher fest, drücken Sie die Schneide in das Gewebe und drehen Sie den Puncher hin und her.
3.Drücken Sie den Kolben, um die Lochscheibe in eine PCR-Reaktionsmischung auszuwerfen. Stellen Sie sicher, dass die Probe in die PCR-Lösung tropft und nicht an den Röhrchenwänden haftet.
4. Reinigen Sie die Schneidkante des Lochers zwischen jeder Probe, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, indem Sie ihn in eine 2%ige NaClO-Lösung eintauchen. Drücken Sie den Kolben ein paar Mal auf und ab und wischen Sie die Schneide mit einem sauberen Papiertuch ab. Die Schneidematte sollte auch zwischen den Proben gespült werden.
5. Verwenden Sie als Nächstes einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 2 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Die PCR-Reaktionen können auch in herkömmlichen PCR-Thermocyclern durchgeführt werden.
6. Zentrieren Sie nach der PCR das Pflanzenmaterial. Übertragen Sie 5 ul des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 4 ul Wasser und 1 ul Restriktionsenzym SspI hinzu. Vorsichtig mischen und kurz herunterzentrifugieren, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung für eine Stunde bei 37 °C. Inaktivieren Sie das Restriktionsenzym durch Inkubation bei 65 °C für 20 min.
7. Bei der Amplifikation von DNA direkt aus Pflanzengewebe enthalten die PCR-Produkte Pflanzen- und PCR-abgeleitete Komponenten, die das Restriktionsverdauungsenzym stören können. Daher kann es erforderlich sein, das PCR-Produkt vor dem anschließenden Verdau entweder zu verdünnen (z. B. 1:2 oder 1:3 in Wasser) oder zu reinigen, z. B. mit einem geeigneten kommerziellen Kit wie dem Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit.
8. Analysieren Sie nach dem Restriktionsenzymverdau die resultierenden Fragmente auf einem Agarosegel. Fügen Sie der Reaktion 2,5 μl 5x Ladepuffer hinzu und führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese mit 10 μl der resultierenden Mischung durch.

2. Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente aus 15 Jahre alten Eichenblättern unter Verwendung des Verdünnungsprotokolls

1.Schneiden Sie zunächst einen 2-mm-Stanzer aus Eichenblatt.
2. Legen Sie die Probe in 20 μl Verdünnungspuffer, der mit dem Phire Plant Direct PCR Kit geliefert wird. Reinigen Sie die Schnittkante des Lochers und der Schneidematte wie zuvor.
3. Die Blattprobe mit einer 100-μl-Pipettenspitze zerdrücken, indem sie kurz gegen die Röhrchenwand gedrückt wird. Je nach Pflanzenmaterial funktioniert das Verdünnungsprotokoll manchmal besser, ohne die Probe zu zerkleinern.
4.Zentrifugieren Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge, bis sich die Reaktionen am Boden der Röhrchen befinden.
5. Der Überstand kann direkt in der PCR verwendet oder je nach Probentyp 1:10 oder 1:100 in sterilem Wasser verdünnt werden. 6.Verwenden Sie 0,5 μl bis 1 μl des Überstands oder der Verdünnung als Matrize für eine 20 μl-PCR-Reaktion. Bereiten Sie die Reaktion wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
7.Sobald die Reaktionen vorbereitet sind, verwenden Sie einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 2 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Die PCR-Reaktionen können auch in herkömmlichen PCR-Thermocyclern durchgeführt werden .
8. Geben Sie nach der PCR 5 μl 5-fachen Ladepuffer zur Reaktion und führen Sie mit 15 μl der resultierenden Mischung eine Agarose-Gelelektrophorese durch.
3. Genotypisierung von transgenen Mäusen unter Verwendung des Verdünnungsprotokolls

1.Beginnen Sie das Verdünnungsprotokoll bei transgenen Mäusen, indem Sie eine 2-mm-Stanze des Mausohrs in 20 μl Verdünnungspuffer mit 0,5 μl DNARelease-Additiv aus dem Phire Animal Tissue Direct PCR Kit geben.
2.Inkubieren Sie die Proben 2 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 2-minütigen Inkubation bei 98 °C.
3. Zentrifugieren Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge, bis sich die Reaktionen am Boden der Röhrchen befinden.
4.Verwenden Sie 1 μl Überstand als Matrize für eine 20 μl PCR-Reaktion, vorbereitet wie in Tabelle 3 beschrieben. Jeder Überstand, der nicht sofort verwendet werden soll, kann in ein neues Röhrchen überführt und bei -20 °C gelagert werden.
5. Verwenden Sie als Nächstes einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 4 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Auch hier können die PCR-Reaktionen auch in herkömmlichen PCR-Cyclern durchgeführt werden.
6. Fügen Sie nach der PCR 5 μl 5x Ladepuffer zur Reaktion hinzu und führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese mit 15 μl der resultierenden Mischung durch.
4. Repräsentative Ergebnisse

Direct Mouse Genotyping Kit

K1025-200 ApexBio 200 rxns 48 EUR

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K1025-500 ApexBio 500 rxns 96 EUR

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Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

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Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

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Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

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Mouse Genotyping Kit

20-abx09888920l Abbexa
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One Step Mouse Genotyping Kit

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One Step U+ Mouse Genotyping Kit

PD104-01 Vazyme 200 rxn 327.6 EUR

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Genotyping Kit

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Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, 400 Reactions

PR1300-MG-400 Benchmark Scientific 1 PC 618.31 EUR

Fast Zebrafish Genotyping System

TBS4035 Tribioscience 250RXNS 198 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for CFTR 508

Z-Path-GT-CFTR-508 Novacyt Group 50 tests 808 EUR

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Z-Path-GT-rs2395185 Novacyt Group 50 tests 808 EUR

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Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, 80 Reactions

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snpsig Real-time PCR Genotyping kit for Prothrombin

Z-Path-GT-Prothrombin-G20210A Novacyt Group 50 tests 808 EUR

TM 2x Genotyping PCR Ready Mix

TBS4003 Tribioscience 2.5 ml 130 EUR

SensiFAST Genotyping Lo-ROX Mix

BIO-34020 Bioline 2000 rxns Ask for price

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PaxView® HPV 20 Genotyping MPCR-ULFA Kit

V0324N PaxGenBio Ltd 96T 576 EUR

PaxView® HPV 20 Genotyping MPCR-ULFA Kit

V0324F PaxGenBio Ltd 48T 288 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for hemochromatosis

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snpsig Real-time PCR Genotyping kit for IL23R codon 381

Z-Path-GT-IL23R-R381Q Novacyt Group 50 tests 808 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for DDC codon M217V

Z-Path-GT-DDC-M217V Novacyt Group 50 tests 808 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for GABBR2 codon 421

Z-Path-GT-GABBR2-421 Novacyt Group 50 tests 808 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for MBL2 codon G57E

Z-Path-GT-MBL2-G57E Novacyt Group 50 tests 808 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for MBL2 codon R52C

Z-Path-GT-MBL2-R52C Novacyt Group 50 tests 808 EUR

HPV (6/11/16/18) Genotyping Real-Time PCR Kit

TRI-J24M1 TRI Biotech 48T 587.16 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for ABL1 codon E255K

Z-Path-GT-ABL1-E255K Novacyt Group 50 tests 808 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for ABL1 codon E255V

Z-Path-GT-ABL1-E255V Novacyt Group 50 tests 808 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for ABL1 codon T315A

Z-Path-GT-ABL1-T315A Novacyt Group 50 tests 808 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for ABL1 codon T315I

Z-Path-GT-ABL1-T315I Novacyt Group 50 tests 808 EUR

snpsig Real-time PCR Genotyping kit for ABL1 codon V299L

Z-Path-GT-ABL1-V299L Novacyt Group 50 tests 808 EUR

Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, Sample, 8 reactions

PR1300-MG-S Benchmark Scientific 1 PC 9.68 EUR

2x Genotyping PCR Ready Master Mix (250 x 20µL rxn)

T403 101Bio 250 rxn 179 EUR

2x Genotyping PCR Ready Master Mix (250 x 20µL rxn)

T403M 101Bio 125 rxn 99 EUR

2x Genotyping PCR Ready Master Mix (250 x 20µL rxn)

T403S 101Bio 50 rxn 49 EUR

order of previously designed custom snpsig genotyping assay

Z-GT-CustomGOI-Inv Novacyt Group 50 rxns 212 EUR

Hemochromatosis Genotyping Kit RT PCR test for detection of His63Asp, Ser65Cys, Cys282Tyr

HM-1-50-T Sacace Biotechnologies 60 763 EUR

CFTR Genetics Real-TM Genotyping NEW Real Time PCR kit for detection of 8 most common CFTR gene mutations:

H943-48FRT Sacace Biotechnologies 48 837.12 EUR

HPV genotypes 14 Real-TM Quant Real Time PCR test for quantitative detection and genotyping of HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68)

V67-100FRT Sacace Biotechnologies 100 1571.78 EUR

Avian A Screening & Avian H5N1 Typing FRT Real Time PCR test for detection of Avian A virus and genotyping for H5N1

R-V33-FRT Sacace Biotechnologies 50 913.42 EUR

HPV genotypes 21 Real-TM Quant Real Time PCR test for quantitative detection and genotyping of HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82)

V21-100FRT Sacace Biotechnologies 96 2594.2 EUR

HPV 14 Screen & 16,18,45 Typing Real-TM Quant Real Time PCR test for quantitative detection of 14 HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68) and genotyping of HPV 16, 18, 45

V31-100-F-FRT Sacace Biotechnologies 100 1325.44 EUR

Mouse tissue direct PCR kit

EP033-200T ELK Biotech 200T 125 EUR

Mouse tissue direct PCR kit

EP033-50T ELK Biotech 50T 40 EUR

Mouse tissue direct PCR kit

EP033 ELK Biotech 50T 125 EUR

Mouse Tissue Direct PCR Kit

RK20736 Abclonal 100RXN 150 EUR

anti-HCV NS5a rabbit polyclonal antibody directed against genotype 2A

MBS485096-01mg MyBiosource 0.1mg 300 EUR

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MBS485096-1mg MyBiosource 1mg 1300 EUR

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MBS485096-5x1mg MyBiosource 5x1mg 5795 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Direct WGA Kit

PCR-382L Jena Bioscience GmbH 100reactions x 20 µl 566.6 EUR

Direct WGA Kit

PCR-382S Jena Bioscience GmbH 20reactions x 20 µl 141.8 EUR

Direct Blood PCR Kit

MBPCR171-100R EWC Diagnostics 1 unit 267.52 EUR

Direct Blood PCR Kit

MBPCR171-10R EWC Diagnostics 1 unit 71.73 EUR

Direct Blood PCR Kit

E0950-01 EURx 100reactions 69.76 EUR

Direct Blood PCR Kit

E0950-02 EURx 500reactions 277.95 EUR

Direct Plant PCR Kit

E0960-01 EURx 100reactions 55.59 EUR

Direct Plant PCR Kit

E0960-02 EURx 500reactions 251.79 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-01 Vazyme 50 rxn (50 μl/rxn) 202.8 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-02 Vazyme 200 rxn (50 μl/rxn) 159.5 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-00-10rxns Vazyme 10 rxns 1.09 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-02-200rxns Vazyme 200 rxns 165.16 EUR

Direct Tissue PCR Kit

E0940-01 EURx 100reactions 55.59 EUR

Direct Tissue PCR Kit

E0940-02 EURx 500reactions 251.79 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700 GeneOn 100 rcs 159.6 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700-2 GeneOn 5x100 rcs 628.8 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx098425-Hitachi7020R150ml4R250ml1 Abbexa Hitachi 7020; R1: 50ml×4 R2: 50ml×1 266.4 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx098425-Hitachi7060R190ml2R245ml1 Abbexa Hitachi 7060; R1: 90ml×2 R2: 45ml×1 266.4 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx098425-Toshiba120R150ml4R250ml1 Abbexa Toshiba 120; R1: 50ml×4 R2: 50ml×1 266.4 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx098425-UniversalR160ml2R230ml1 Abbexa Universal; R1: 60ml×2 R2: 30ml×1 284.4 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx294061-100g Abbexa 100 µg Ask for price

Direct Bilirubin Assay Kit

abx294061-20g Abbexa 20 µg 400 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx294061-50g Abbexa 50 µg Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-01 Vazyme 50 rxn 51.41 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-02 Vazyme 200 rxn 188.5 EUR

Mouse Direct High-Density-Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) ELISA Kit

MBS3806172-10x96StripWells MyBiosource 10x96-Strip-Wells 6725 EUR

Mouse Direct High-Density-Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) ELISA Kit

MBS3806172-48StripWells MyBiosource 48-Strip-Wells 550 EUR

Mouse Direct High-Density-Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) ELISA Kit

MBS3806172-5x96StripWells MyBiosource 5x96-Strip-Wells 3420 EUR

Mouse Direct High-Density-Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) ELISA Kit

MBS3806172-96StripWells MyBiosource 96-Strip-Wells 765 EUR

Direct Red 80

TD0098-10mg TargetMol Chemicals 10mg Ask for price

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Direct Red 80

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Direct Red 80

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MBS5786703-5mg MyBiosource 5(mg 145 EUR

Direct Red 80

MBS5786703-5x1g MyBiosource 5x1g 500 EUR

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MBS5786703-5x5mg MyBiosource 5x5mg 500 EUR

Direct Blue 71

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Direct Blue 1

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Direct Green 6

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Direct Green 6

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Direct Black 38

T15135-10mg TargetMol Chemicals 10mg Ask for price

Direct Black 38

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Direct Black 38

T15135-1mg TargetMol Chemicals 1mg Ask for price

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T15135-5mg TargetMol Chemicals 5mg Ask for price

Direct Green 6

MBS5781130-INQUIRE MyBiosource INQUIRE Ask for price

Direct Black 38

MBS5754793-100mg MyBiosource 100mg 145 EUR

Direct Black 38

MBS5754793-5x100mg MyBiosource 5x100mg 500 EUR

Direct Violet 1

596135 MedKoo Biosciences 25.0g 230 EUR

Direct Yellow 26

464247 MedKoo Biosciences 10.0mg Ask for price

Direct Yellow 11

D494828 Toronto Research Chemicals 10g 800 EUR

PCP Direct ELISA

GWB-BQK187 GenWay Biotech 96 Well Plate Ask for price

Direct Violet 1

T20033-10mg TargetMol Chemicals 10mg Ask for price

Direct Violet 1

T20033-1g TargetMol Chemicals 1g Ask for price

Direct Violet 1

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Direct Violet 1

T20033-50mg TargetMol Chemicals 50mg Ask for price

Direct Violet 1

T20033-5mg TargetMol Chemicals 5mg Ask for price

Direct Violet 1

MBS5765613-100mg MyBiosource 100mg 245 EUR

Direct Violet 1

MBS5765613-10mg MyBiosource 10mg 145 EUR

Direct Violet 1

MBS5765613-200mg MyBiosource 200mg 315 EUR

Direct Violet 1

MBS5765613-25mg MyBiosource 25mg 165 EUR

Direct Violet 1

MBS5765613-50mg MyBiosource 50mg 195 EUR

Renin ELISA (Direct)

GWB-013014 GenWay Biotech 96 Tests Ask for price

Cotinine Direct ELISA

GWB-BQK0DA GenWay Biotech 96 well plate Ask for price

Probe Direct SuperMix

abx461057-1096tests Abbexa 10 × 96 tests Ask for price

Probe Direct SuperMix

abx461057-596tests Abbexa 5 × 96 tests 2800 EUR

Probe Direct SuperMix

abx461057-96tests Abbexa 96 tests 812.5 EUR

Methadone Direct ELISA

GWB-BQK185 GenWay Biotech 96 Well Plate Ask for price

cAMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric)

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cGMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric)

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Bei der dCAPS-

Technik wird die Restriktionsstelle innerhalb des interessierenden SNP entweder eingeführt oder zerstört, indem ein PCR-Primer mit einer oder mehreren Fehlpaarungen mit der Ziel-DNA verwendet wird. Die Genotypisierung von Arabidopsis-Pflanzenindividuen wurde mit der dCAPS-Technik direkt aus Blattstanzen durchgeführt. Die amplifizierten Produkte wurden verdaut und die resultierenden Fragmente, die den Genotyp jedes Individuums enthüllten, wurden durch Gelelektrophorese analysiert

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