• Mai 22, 2022

Kit zur direkten Maus-Genotypisierung

Abstrakt
Der direkte PCR-Ansatz erleichtert die PCR-Amplifikation direkt aus kleinen Mengen ungereinigter Proben und wird hier für mehrere pflanzliche und tierische Gewebe demonstriert. Die direkte PCR basiert auf speziell entwickelten Phusion- und Phire-DNA-Polymerasen von Thermo Scientific, die eine doppelsträngige DNA-Bindungsdomäne enthalten, die ihnen einzigartige Eigenschaften wie eine hohe Toleranz gegenüber Inhibitoren verleiht.

Der PCR-basierte Ziel-DNA-Nachweis hat zahlreiche Anwendungen in der Pflanzenforschung, einschließlich der Analyse von Pflanzengenotypen und der Verifizierung von Transgenen.

Die PCR aus Pflanzengewebe beinhaltet traditionell einen anfänglichen DNA-Isolierungsschritt, der teure oder toxische Reagenzien erfordern kann. Der Prozess ist zeitaufwändig und erhöht das Risiko einer Kreuzkontamination1, 2.

  • Umgekehrt kann die Ziel-DNA mit dem Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit ohne vorherige DNA-Extraktion leicht nachgewiesen werden. In dem hier gezeigten Modell wird ein Beispiel für abgeleitete gespaltene amplifizierte polymorphe Sequenzanalysen (dCAPS)3,4 direkt an Arabidopsis-Pflanzenblättern durchgeführt. dCAPS-Genotypisierungsassays können verwendet werden, um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) durch SNP-Allel-spezifische Restriktionsendonuklease-Verdauung zu identifizieren3.
  • Einige Pflanzenproben sind bei der Verwendung von direkten PCR-Methoden tendenziell schwieriger, da sie Komponenten enthalten, die die PCR stören, wie z. B. phenolische Verbindungen.
  • In diesen Fällen ist traditionell ein zusätzlicher Schritt zur Entfernung der Verbindungen erforderlich2,5. Hier wird dieses Problem überwunden, indem ein schnelles und einfaches Verdünnungsprotokoll gefolgt von einer direkten PCR-Amplifikation verwendet wird. Fünfzehn Jahre alte Eichenblätter werden als Modell für herausfordernde Pflanzen verwendet, da das Exemplar hohe Mengen an phenolischen Verbindungen einschließlich Tanninen enthält.
  • Der Gentransfer in Mäuse wird allgemein verwendet, um die Rolle von Genen in der Entwicklung, Physiologie und menschlichen Krankheiten zu untersuchen. Die Verwendung dieser Tiere erfordert ein Screening auf das Vorhandensein des Transgens, üblicherweise mit PCR.
  • Traditionell beinhaltet dies einen zeitaufwändigen DNA-Isolierungsschritt, während dessen DNA für die PCR-Analyse aus Ohr-, Schwanz- oder Zehengewebe gereinigt wird6,7. Mit dem Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit können transgene Mäuse jedoch ohne vorherige DNA-Reinigung genotypisiert werden. In diesem Protokoll erfolgt die transgene Maus-Genotypisierung direkt aus Mausohrgeweben, wie hier für ein herausforderndes Beispiel gezeigt, bei dem nur ein Primersatz zur Amplifikation von zwei Fragmenten mit stark unterschiedlicher Größe verwendet wird.

Protokoll

1. Genotypisierung von Arabidopsis-Pflanzenindividuen mit direktem Protokoll

1Um mit dem dCAPS-Genotypisierungsassay direkt auf dem Blatt der Arabidopsis-Pflanze zu beginnen, formulieren Sie zuerst 20 oder 50 μl PCR-Reaktionen mit dem Phire Plant Direct PCR Kit .
2Schneiden Sie als Nächstes mit dem Harris Uni-Core und der Harris-Schneidmatte einen 0,50-mm-Stanzer aus einem Arabidopsis-Pflanzenblatt. Halten Sie den Puncher fest, drücken Sie die Schneide in das Gewebe und drehen Sie den Puncher hin und her.
3.Drücken Sie den Kolben, um die Lochscheibe in eine PCR-Reaktionsmischung auszuwerfen. Stellen Sie sicher, dass die Probe in die PCR-Lösung tropft und nicht an den Röhrchenwänden haftet.
4. Reinigen Sie die Schneidkante des Lochers zwischen jeder Probe, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, indem Sie ihn in eine 2%ige NaClO-Lösung eintauchen. Drücken Sie den Kolben ein paar Mal auf und ab und wischen Sie die Schneide mit einem sauberen Papiertuch ab. Die Schneidematte sollte auch zwischen den Proben gespült werden.
5. Verwenden Sie als Nächstes einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 2 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Die PCR-Reaktionen können auch in herkömmlichen PCR-Thermocyclern durchgeführt werden.
6. Zentrieren Sie nach der PCR das Pflanzenmaterial. Übertragen Sie 5 ul des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 4 ul Wasser und 1 ul Restriktionsenzym SspI hinzu. Vorsichtig mischen und kurz herunterzentrifugieren, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung für eine Stunde bei 37 °C. Inaktivieren Sie das Restriktionsenzym durch Inkubation bei 65 °C für 20 min.
7. Bei der Amplifikation von DNA direkt aus Pflanzengewebe enthalten die PCR-Produkte Pflanzen- und PCR-abgeleitete Komponenten, die das Restriktionsverdauungsenzym stören können. Daher kann es erforderlich sein, das PCR-Produkt vor dem anschließenden Verdau entweder zu verdünnen (z. B. 1:2 oder 1:3 in Wasser) oder zu reinigen, z. B. mit einem geeigneten kommerziellen Kit wie dem Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit.
8. Analysieren Sie nach dem Restriktionsenzymverdau die resultierenden Fragmente auf einem Agarosegel. Fügen Sie der Reaktion 2,5 μl 5x Ladepuffer hinzu und führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese mit 10 μl der resultierenden Mischung durch.

2. Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente aus 15 Jahre alten Eichenblättern unter Verwendung des Verdünnungsprotokolls

1.Schneiden Sie zunächst einen 2-mm-Stanzer aus Eichenblatt.
2. Legen Sie die Probe in 20 μl Verdünnungspuffer, der mit dem Phire Plant Direct PCR Kit geliefert wird. Reinigen Sie die Schnittkante des Lochers und der Schneidematte wie zuvor.
3. Die Blattprobe mit einer 100-μl-Pipettenspitze zerdrücken, indem sie kurz gegen die Röhrchenwand gedrückt wird. Je nach Pflanzenmaterial funktioniert das Verdünnungsprotokoll manchmal besser, ohne die Probe zu zerkleinern.
4.Zentrifugieren Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge, bis sich die Reaktionen am Boden der Röhrchen befinden.
5. Der Überstand kann direkt in der PCR verwendet oder je nach Probentyp 1:10 oder 1:100 in sterilem Wasser verdünnt werden. 6.Verwenden Sie 0,5 μl bis 1 μl des Überstands oder der Verdünnung als Matrize für eine 20 μl-PCR-Reaktion. Bereiten Sie die Reaktion wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
7.Sobald die Reaktionen vorbereitet sind, verwenden Sie einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 2 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Die PCR-Reaktionen können auch in herkömmlichen PCR-Thermocyclern durchgeführt werden .
8. Geben Sie nach der PCR 5 μl 5-fachen Ladepuffer zur Reaktion und führen Sie mit 15 μl der resultierenden Mischung eine Agarose-Gelelektrophorese durch.
3. Genotypisierung von transgenen Mäusen unter Verwendung des Verdünnungsprotokolls

1.Beginnen Sie das Verdünnungsprotokoll bei transgenen Mäusen, indem Sie eine 2-mm-Stanze des Mausohrs in 20 μl Verdünnungspuffer mit 0,5 μl DNARelease-Additiv aus dem Phire Animal Tissue Direct PCR Kit geben.
2.Inkubieren Sie die Proben 2 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 2-minütigen Inkubation bei 98 °C.
3. Zentrifugieren Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge, bis sich die Reaktionen am Boden der Röhrchen befinden.
4.Verwenden Sie 1 μl Überstand als Matrize für eine 20 μl PCR-Reaktion, vorbereitet wie in Tabelle 3 beschrieben. Jeder Überstand, der nicht sofort verwendet werden soll, kann in ein neues Röhrchen überführt und bei -20 °C gelagert werden.
5. Verwenden Sie als Nächstes einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 4 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Auch hier können die PCR-Reaktionen auch in herkömmlichen PCR-Cyclern durchgeführt werden.
6. Fügen Sie nach der PCR 5 μl 5x Ladepuffer zur Reaktion hinzu und führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese mit 15 μl der resultierenden Mischung durch.
4. Repräsentative Ergebnisse

Direct Mouse Genotyping Kit

K1025-200 ApexBio 200 rxns 142.8 EUR

Direct Mouse Genotyping Kit

K1025-500 ApexBio 500 rxns 226.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40013 Bimake 200 ractions 250.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40015 Bimake 500 ractions 490.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45012 Bimake 1ml*5 (500 ractions) 336 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45013 Bimake 1ml*20 (2000 ractions) 1038 EUR

Mouse Genotyping Kit

20-abx09888920l Abbexa
  • 376.80 EUR
  • 978.00 EUR
  • 100 rxns×20 µl
  • 500 rxns×20 µl

One Step Mouse Genotyping Kit

PD101-01 Vazyme 200 rxn 259.2 EUR

Genotyping Kit

K1026-200 ApexBio 200 rxns 142.8 EUR

Genotyping Kit

K1026-500 ApexBio 500 rxns 226.8 EUR

One Step U+ Mouse Genotyping Kit

PD104-01 Vazyme 200 rxn 327.6 EUR

TARGATT? Knock-in iPSC Genotyping Kit

AST-1102 Applied StemCell 1 Kit Ask for price

SensiFAST Genotyping Lo-Rox Kit

BIO-34005 Bioline 500 Reactions Ask for price

SensiFAST Genotyping Hi-Rox Kit

BIO-35005 Bioline 500 Reactions Ask for price

Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, 400 Reactions

PR1300-MG-400 Benchmark Scientific 1 PC 600.3 EUR

SensiFAST Genotyping Lo-ROX Mix

BIO-34020 Bioline 2000 rxns Ask for price

SensiFAST Genotyping Hi-ROX Mix

BIO-35020 Bioline 2000 rxns Ask for price

Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, 80 Reactions

PR1300-MG-80 Benchmark Scientific 1 PC 137.7 EUR

Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, Sample, 8 reactions

PR1300-MG-S Benchmark Scientific 1 PC 9.4 EUR

2x Genotyping PCR Ready Master Mix (250 x 20µL rxn)

T403 101Bio - Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Plant Direct PCR Kit

PD105-01 Vazyme 50 rxn (50 μl/rxn) 202.8 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-02 Vazyme 200 rxn (50 μl/rxn) 424.8 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700 GeneOn 100 rcs 159.6 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700-2 GeneOn 5x100 rcs 628.8 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx098425-Hitachi7020R150ml4R250ml1 Abbexa Hitachi 7020; R1: 50ml×4 R2: 50ml×1 266.4 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx098425-Hitachi7060R190ml2R245ml1 Abbexa Hitachi 7060; R1: 90ml×2 R2: 45ml×1 266.4 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx098425-Toshiba120R150ml4R250ml1 Abbexa Toshiba 120; R1: 50ml×4 R2: 50ml×1 266.4 EUR

Direct Bilirubin Assay Kit

abx098425-UniversalR160ml2R230ml1 Abbexa Universal; R1: 60ml×2 R2: 30ml×1 284.4 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-01 Vazyme 50 rxn 202.8 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-02 Vazyme 200 rxn 424.8 EUR

Direct Black 38

HY-D0256 MedChemExpress 100mg 129.6 EUR

Direct Tube Marker

PCR1414 Scientific Laboratory Supplies EACH 7038 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Direct-Q½ 3 UV

ZRQSVP300 Scientific Laboratory Supplies EACH 6657.25 EUR

Direct-Q½ 5 UV

ZRQSVP500 Scientific Laboratory Supplies EACH 7077.66 EUR

Direct-Q½ 8 UV

ZRQSVP800 Scientific Laboratory Supplies EACH 7209.52 EUR

Milli-Q½ Direct 8

ZR0Q00800 Scientific Laboratory Supplies EACH 10956.6 EUR

Milli-Q½ Direct 16

ZR0Q01600 Scientific Laboratory Supplies EACH 13535.16 EUR

Direct-Q½ 3 Remote

ZRQS0R300 Scientific Laboratory Supplies EACH 6867.46 EUR

cGMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric)

K372-100 Biovision each 614.4 EUR

cAMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric)

K2044-100 ApexBio 100 assays 634.8 EUR

cGMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric)

K2066-100 ApexBio 100 assays 634.8 EUR

cAMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric)

K371-100 Biovision each 614.4 EUR

Direct Red 80 (C.I. 35780)

GT1078-100G Glentham Life Sciences 100 g 217.2 EUR

Direct Red 80 (C.I. 35780)

GT1078-25G Glentham Life Sciences 25 g 93.6 EUR

Direct Red 80 (C.I. 35780)

GT1078-5G Glentham Life Sciences 5 g 55.2 EUR

Direct Red 80 (C.I. 35780)

GT1078-100 Glentham Life Sciences 100 150.4 EUR

Direct Red 80 (C.I. 35780)

GT1078-25 Glentham Life Sciences 25 47.4 EUR

Direct Red 80 (C.I. 35780)

GT1078-5 Glentham Life Sciences 5 15.9 EUR

Ecl Direct Nucleic Acid

RPN3000 Scientific Laboratory Supplies EACH 1122 EUR

Ecl Direct Nucleic Acid

RPN3001 Scientific Laboratory Supplies EACH 1899.6 EUR

Ecl Direct Nucleic Acid

RPN3005 Scientific Laboratory Supplies EACH 834 EUR

EZCell? Direct Glucose Uptake Assay Kit

K924-50 Biovision each 888 EUR

Direct Blue 199 (C.I. 74190)

GT1468-100G Glentham Life Sciences 100 g 237.6 EUR

Direct Blue 199 (C.I. 74190)

GT1468-10G Glentham Life Sciences 10 g 74.4 EUR

Direct Blue 199 (C.I. 74190)

GT1468-25G Glentham Life Sciences 25 g 103.2 EUR

Direct Blue 199 (C.I. 74190)

GT1468-10 Glentham Life Sciences 10 31.7 EUR

Direct Blue 199 (C.I. 74190)

GT1468-100 Glentham Life Sciences 100 166 EUR

Direct Blue 199 (C.I. 74190)

GT1468-25 Glentham Life Sciences 25 55.4 EUR

Direct PCRKits for Blood

FYT302-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct PCRKits for Plant

FYT303-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Human Mumps IgG ELISA Kit (Direct EIA)

EK7073 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Mumps IgM ELISA Kit (Direct EIA)

EK7074 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Cyclic AMP Direct ELISA Kit (1 Plate)

K019-H1 Arbor Assays 1x96 well plate 395 EUR

Cyclic AMP Direct ELISA Kit (5 Plate)

K019-H5 Arbor Assays 5x96 well plate 1557 EUR

Cyclic GMP Direct ELISA Kit (1 Plate)

K020-H1 Arbor Assays 1x96 well plate 407 EUR

Cyclic GMP Direct ELISA Kit (5 Plate)

K020-H5 Arbor Assays 5x96 well plate 1593 EUR

Direct Yellow 50 (C.I. 29025)

GT5274-100G Glentham Life Sciences 100 g 144 EUR

Direct Yellow 50 (C.I. 29025)

GT5274-25G Glentham Life Sciences 25 g 79.2 EUR

Direct Yellow 50 (C.I. 29025)

GT5274-100 Glentham Life Sciences 100 89.3 EUR

Direct Yellow 50 (C.I. 29025)

GT5274-25 Glentham Life Sciences 25 35.5 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-540 GeneOn 20 rcs x 50 µl 196.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-542 GeneOn 100 rcs x 50 µl 658.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-544 GeneOn 1000 rcs x 50 µl 5026.8 EUR

ANA IgG Screening ELISA Kit (Direct EIA)

EK7016 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Rubella IgG ELISA Kit (Direct EIA)

EK7082 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Rubella IgM ELISA Kit (Direct EIA)

EK7083 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Direct-Q½ 3 UV Remote

ZRQSVR300 Scientific Laboratory Supplies EACH 7656.04 EUR

Direct-Q½ 5 UV Remote

ZRQSVR500 Scientific Laboratory Supplies EACH 8143.03 EUR

Direct-Q½ 8 UV Remote

ZRQSVR800 Scientific Laboratory Supplies EACH 8286.64 EUR

FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions

4615 Intact Genomics 1/EA 621.6 EUR

Human Brucella IgG ELISA Kit (Direct EIA)

EK7021 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Brucella IgM ELISA Kit (Direct EIA)

EK7022 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human HSV-1 IgG ELISA Kit (Direct EIA)

EK7058 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human HSV-1 IgM ELISA Kit (Direct EIA)

EK7059 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human HSV-2 IgG ELISA Kit (Direct EIA)

EK7060 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human HSV-2 IgM ELISA Kit (Direct EIA)

EK7061 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Toxoplasma IgG ELISA Kit (Direct EIA)

EK7099 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Toxoplasma IgA ELISA Kit (Direct EIA)

EK7100 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Toxoplasma IgM ELISA Kit (Direct EIA)

EK7101 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Cardiolipin IgG ELISA Kit (Direct EIA)

EK7024 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Cardiolipin IgA ELISA Kit (Direct EIA)

EK7025 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Human Cardiolipin IgM ELISA Kit (Direct EIA)

EK7026 BosterBio 96wells/kit, with removable strips. 573.6 EUR

Direct Cyclic GMP (cGMP) ELISA Kit (1 Plate)

K065-H1 Arbor Assays 1x96 well plate 407 EUR

Direct Cyclic GMP (cGMP) ELISA Kit (5 Plate)

K065-H5 Arbor Assays 5x96 well plate 1593 EUR

Alkphos Direct Labelling Reagents

RPN3680 Scientific Laboratory Supplies EACH 813.6 EUR

Alkphos Direct Hybridisation Buffer

RPN3688 Scientific Laboratory Supplies EACH 770.4 EUR

Bei der dCAPS-

Technik wird die Restriktionsstelle innerhalb des interessierenden SNP entweder eingeführt oder zerstört, indem ein PCR-Primer mit einer oder mehreren Fehlpaarungen mit der Ziel-DNA verwendet wird. Die Genotypisierung von Arabidopsis-Pflanzenindividuen wurde mit der dCAPS-Technik direkt aus Blattstanzen durchgeführt. Die amplifizierten Produkte wurden verdaut und die resultierenden Fragmente, die den Genotyp jedes Individuums enthüllten, wurden durch Gelelektrophorese analysiert

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