Kit zur direkten Maus-Genotypisierung
Abstrakt
Der direkte PCR-Ansatz erleichtert die PCR-Amplifikation direkt aus kleinen Mengen ungereinigter Proben und wird hier für mehrere pflanzliche und tierische Gewebe demonstriert. Die direkte PCR basiert auf speziell entwickelten Phusion- und Phire-DNA-Polymerasen von Thermo Scientific, die eine doppelsträngige DNA-Bindungsdomäne enthalten, die ihnen einzigartige Eigenschaften wie eine hohe Toleranz gegenüber Inhibitoren verleiht.
Der PCR-basierte Ziel-DNA-Nachweis hat zahlreiche Anwendungen in der Pflanzenforschung, einschließlich der Analyse von Pflanzengenotypen und der Verifizierung von Transgenen.
Die PCR aus Pflanzengewebe beinhaltet traditionell einen anfänglichen DNA-Isolierungsschritt, der teure oder toxische Reagenzien erfordern kann. Der Prozess ist zeitaufwändig und erhöht das Risiko einer Kreuzkontamination1, 2.
- Umgekehrt kann die Ziel-DNA mit dem Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit ohne vorherige DNA-Extraktion leicht nachgewiesen werden. In dem hier gezeigten Modell wird ein Beispiel für abgeleitete gespaltene amplifizierte polymorphe Sequenzanalysen (dCAPS)3,4 direkt an Arabidopsis-Pflanzenblättern durchgeführt. dCAPS-Genotypisierungsassays können verwendet werden, um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) durch SNP-Allel-spezifische Restriktionsendonuklease-Verdauung zu identifizieren3.
- Einige Pflanzenproben sind bei der Verwendung von direkten PCR-Methoden tendenziell schwieriger, da sie Komponenten enthalten, die die PCR stören, wie z. B. phenolische Verbindungen.
- In diesen Fällen ist traditionell ein zusätzlicher Schritt zur Entfernung der Verbindungen erforderlich2,5. Hier wird dieses Problem überwunden, indem ein schnelles und einfaches Verdünnungsprotokoll gefolgt von einer direkten PCR-Amplifikation verwendet wird. Fünfzehn Jahre alte Eichenblätter werden als Modell für herausfordernde Pflanzen verwendet, da das Exemplar hohe Mengen an phenolischen Verbindungen einschließlich Tanninen enthält.
- Der Gentransfer in Mäuse wird allgemein verwendet, um die Rolle von Genen in der Entwicklung, Physiologie und menschlichen Krankheiten zu untersuchen. Die Verwendung dieser Tiere erfordert ein Screening auf das Vorhandensein des Transgens, üblicherweise mit PCR.
- Traditionell beinhaltet dies einen zeitaufwändigen DNA-Isolierungsschritt, während dessen DNA für die PCR-Analyse aus Ohr-, Schwanz- oder Zehengewebe gereinigt wird6,7. Mit dem Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit können transgene Mäuse jedoch ohne vorherige DNA-Reinigung genotypisiert werden. In diesem Protokoll erfolgt die transgene Maus-Genotypisierung direkt aus Mausohrgeweben, wie hier für ein herausforderndes Beispiel gezeigt, bei dem nur ein Primersatz zur Amplifikation von zwei Fragmenten mit stark unterschiedlicher Größe verwendet wird.
Protokoll
1. Genotypisierung von Arabidopsis-Pflanzenindividuen mit direktem Protokoll
1Um mit dem dCAPS-Genotypisierungsassay direkt auf dem Blatt der Arabidopsis-Pflanze zu beginnen, formulieren Sie zuerst 20 oder 50 μl PCR-Reaktionen mit dem Phire Plant Direct PCR Kit .
2Schneiden Sie als Nächstes mit dem Harris Uni-Core und der Harris-Schneidmatte einen 0,50-mm-Stanzer aus einem Arabidopsis-Pflanzenblatt. Halten Sie den Puncher fest, drücken Sie die Schneide in das Gewebe und drehen Sie den Puncher hin und her.
3.Drücken Sie den Kolben, um die Lochscheibe in eine PCR-Reaktionsmischung auszuwerfen. Stellen Sie sicher, dass die Probe in die PCR-Lösung tropft und nicht an den Röhrchenwänden haftet.
4. Reinigen Sie die Schneidkante des Lochers zwischen jeder Probe, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, indem Sie ihn in eine 2%ige NaClO-Lösung eintauchen. Drücken Sie den Kolben ein paar Mal auf und ab und wischen Sie die Schneide mit einem sauberen Papiertuch ab. Die Schneidematte sollte auch zwischen den Proben gespült werden.
5. Verwenden Sie als Nächstes einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 2 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Die PCR-Reaktionen können auch in herkömmlichen PCR-Thermocyclern durchgeführt werden.
6. Zentrieren Sie nach der PCR das Pflanzenmaterial. Übertragen Sie 5 ul des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 4 ul Wasser und 1 ul Restriktionsenzym SspI hinzu. Vorsichtig mischen und kurz herunterzentrifugieren, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung für eine Stunde bei 37 °C. Inaktivieren Sie das Restriktionsenzym durch Inkubation bei 65 °C für 20 min.
7. Bei der Amplifikation von DNA direkt aus Pflanzengewebe enthalten die PCR-Produkte Pflanzen- und PCR-abgeleitete Komponenten, die das Restriktionsverdauungsenzym stören können. Daher kann es erforderlich sein, das PCR-Produkt vor dem anschließenden Verdau entweder zu verdünnen (z. B. 1:2 oder 1:3 in Wasser) oder zu reinigen, z. B. mit einem geeigneten kommerziellen Kit wie dem Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit.
8. Analysieren Sie nach dem Restriktionsenzymverdau die resultierenden Fragmente auf einem Agarosegel. Fügen Sie der Reaktion 2,5 μl 5x Ladepuffer hinzu und führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese mit 10 μl der resultierenden Mischung durch.
2. Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente aus 15 Jahre alten Eichenblättern unter Verwendung des Verdünnungsprotokolls
1.Schneiden Sie zunächst einen 2-mm-Stanzer aus Eichenblatt.
2. Legen Sie die Probe in 20 μl Verdünnungspuffer, der mit dem Phire Plant Direct PCR Kit geliefert wird. Reinigen Sie die Schnittkante des Lochers und der Schneidematte wie zuvor.
3. Die Blattprobe mit einer 100-μl-Pipettenspitze zerdrücken, indem sie kurz gegen die Röhrchenwand gedrückt wird. Je nach Pflanzenmaterial funktioniert das Verdünnungsprotokoll manchmal besser, ohne die Probe zu zerkleinern.
4.Zentrifugieren Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge, bis sich die Reaktionen am Boden der Röhrchen befinden.
5. Der Überstand kann direkt in der PCR verwendet oder je nach Probentyp 1:10 oder 1:100 in sterilem Wasser verdünnt werden. 6.Verwenden Sie 0,5 μl bis 1 μl des Überstands oder der Verdünnung als Matrize für eine 20 μl-PCR-Reaktion. Bereiten Sie die Reaktion wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
7.Sobald die Reaktionen vorbereitet sind, verwenden Sie einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 2 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Die PCR-Reaktionen können auch in herkömmlichen PCR-Thermocyclern durchgeführt werden .
8. Geben Sie nach der PCR 5 μl 5-fachen Ladepuffer zur Reaktion und führen Sie mit 15 μl der resultierenden Mischung eine Agarose-Gelelektrophorese durch.
3. Genotypisierung von transgenen Mäusen unter Verwendung des Verdünnungsprotokolls
1.Beginnen Sie das Verdünnungsprotokoll bei transgenen Mäusen, indem Sie eine 2-mm-Stanze des Mausohrs in 20 μl Verdünnungspuffer mit 0,5 μl DNARelease-Additiv aus dem Phire Animal Tissue Direct PCR Kit geben.
2.Inkubieren Sie die Proben 2 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 2-minütigen Inkubation bei 98 °C.
3. Zentrifugieren Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge, bis sich die Reaktionen am Boden der Röhrchen befinden.
4.Verwenden Sie 1 μl Überstand als Matrize für eine 20 μl PCR-Reaktion, vorbereitet wie in Tabelle 3 beschrieben. Jeder Überstand, der nicht sofort verwendet werden soll, kann in ein neues Röhrchen überführt und bei -20 °C gelagert werden.
5. Verwenden Sie als Nächstes einen Thermo Scientific Piko 24-Well-Thermocycler und eine Thermo Scientific Piko PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in Tabelle 4 beschriebenen Zyklusbedingungen durchzuführen. Auch hier können die PCR-Reaktionen auch in herkömmlichen PCR-Cyclern durchgeführt werden.
6. Fügen Sie nach der PCR 5 μl 5x Ladepuffer zur Reaktion hinzu und führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese mit 15 μl der resultierenden Mischung durch.
4. Repräsentative Ergebnisse
Direct Mouse Genotyping Kit |
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| K1025-200 | ApexBio | 200 rxns | 142.8 EUR |
Direct Mouse Genotyping Kit |
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| K1025-500 | ApexBio | 500 rxns | 226.8 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
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| B40013 | Bimake | 200 ractions | 250.8 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
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| B40015 | Bimake | 500 ractions | 490.8 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
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| B45012 | Bimake | 1ml*5 (500 ractions) | 336 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
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| B45013 | Bimake | 1ml*20 (2000 ractions) | 1038 EUR |
Mouse Genotyping Kit |
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| 20-abx09888920l | Abbexa |
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One Step Mouse Genotyping Kit |
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| PD101-01 | Vazyme | 200 rxn | 259.2 EUR |
Genotyping Kit |
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| K1026-200 | ApexBio | 200 rxns | 142.8 EUR |
Genotyping Kit |
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| K1026-500 | ApexBio | 500 rxns | 226.8 EUR |
One Step U+ Mouse Genotyping Kit |
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| PD104-01 | Vazyme | 200 rxn | 327.6 EUR |
TARGATT? Knock-in iPSC Genotyping Kit |
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| AST-1102 | Applied StemCell | 1 Kit | Ask for price |
SensiFAST Genotyping Lo-Rox Kit |
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| BIO-34005 | Bioline | 500 Reactions | Ask for price |
SensiFAST Genotyping Hi-Rox Kit |
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| BIO-35005 | Bioline | 500 Reactions | Ask for price |
Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, 400 Reactions |
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| PR1300-MG-400 | Benchmark Scientific | 1 PC | 600.3 EUR |
SensiFAST Genotyping Lo-ROX Mix |
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| BIO-34020 | Bioline | 2000 rxns | Ask for price |
SensiFAST Genotyping Hi-ROX Mix |
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| BIO-35020 | Bioline | 2000 rxns | Ask for price |
Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, 80 Reactions |
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| PR1300-MG-80 | Benchmark Scientific | 1 PC | 137.7 EUR |
Accuris 1 Hour Mammalian Genotyping Kit, Sample, 8 reactions |
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| PR1300-MG-S | Benchmark Scientific | 1 PC | 9.4 EUR |
2x Genotyping PCR Ready Master Mix (250 x 20µL rxn) |
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| T403 | 101Bio | - | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit |
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| ABP-PP-MT02100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit |
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| ABP-PP-MT02500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
Plant Direct PCR Kit |
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| PD105-01 | Vazyme | 50 rxn (50 μl/rxn) | 202.8 EUR |
Plant Direct PCR Kit |
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| PD105-02 | Vazyme | 200 rxn (50 μl/rxn) | 424.8 EUR |
Direct PCR Complete Kit |
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| S700 | GeneOn | 100 rcs | 159.6 EUR |
Direct PCR Complete Kit |
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| S700-2 | GeneOn | 5x100 rcs | 628.8 EUR |
Direct Bilirubin Assay Kit |
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| abx098425-Hitachi7020R150ml4R250ml1 | Abbexa | Hitachi 7020; R1: 50ml×4 R2: 50ml×1 | 266.4 EUR |
Direct Bilirubin Assay Kit |
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| abx098425-Hitachi7060R190ml2R245ml1 | Abbexa | Hitachi 7060; R1: 90ml×2 R2: 45ml×1 | 266.4 EUR |
Direct Bilirubin Assay Kit |
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| abx098425-Toshiba120R150ml4R250ml1 | Abbexa | Toshiba 120; R1: 50ml×4 R2: 50ml×1 | 266.4 EUR |
Direct Bilirubin Assay Kit |
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| abx098425-UniversalR160ml2R230ml1 | Abbexa | Universal; R1: 60ml×2 R2: 30ml×1 | 284.4 EUR |
Blood Direct PCR Kit V2 |
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| PD103-01 | Vazyme | 50 rxn | 202.8 EUR |
Blood Direct PCR Kit V2 |
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| PD103-02 | Vazyme | 200 rxn | 424.8 EUR |
Direct Black 38 |
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| HY-D0256 | MedChemExpress | 100mg | 129.6 EUR |
Direct Tube Marker |
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| PCR1414 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 7038 EUR |
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer |
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| ABP-PP-MT01100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer |
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| ABP-PP-MT01500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
Direct-Q½ 3 UV |
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| ZRQSVP300 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 6657.25 EUR |
Direct-Q½ 5 UV |
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| ZRQSVP500 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 7077.66 EUR |
Direct-Q½ 8 UV |
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| ZRQSVP800 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 7209.52 EUR |
Milli-Q½ Direct 8 |
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| ZR0Q00800 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 10956.6 EUR |
Milli-Q½ Direct 16 |
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| ZR0Q01600 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 13535.16 EUR |
Direct-Q½ 3 Remote |
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| ZRQS0R300 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 6867.46 EUR |
cGMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric) |
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| K372-100 | Biovision | each | 614.4 EUR |
cAMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric) |
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| K2044-100 | ApexBio | 100 assays | 634.8 EUR |
cGMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric) |
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| K2066-100 | ApexBio | 100 assays | 634.8 EUR |
cAMP Direct Immunoassay Kit (Colorimetric) |
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| K371-100 | Biovision | each | 614.4 EUR |
Direct Red 80 (C.I. 35780) |
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| GT1078-100G | Glentham Life Sciences | 100 g | 217.2 EUR |
Direct Red 80 (C.I. 35780) |
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| GT1078-25G | Glentham Life Sciences | 25 g | 93.6 EUR |
Direct Red 80 (C.I. 35780) |
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| GT1078-5G | Glentham Life Sciences | 5 g | 55.2 EUR |
Direct Red 80 (C.I. 35780) |
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| GT1078-100 | Glentham Life Sciences | 100 | 150.4 EUR |
Direct Red 80 (C.I. 35780) |
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| GT1078-25 | Glentham Life Sciences | 25 | 47.4 EUR |
Direct Red 80 (C.I. 35780) |
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| GT1078-5 | Glentham Life Sciences | 5 | 15.9 EUR |
Ecl Direct Nucleic Acid |
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| RPN3000 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 1122 EUR |
Ecl Direct Nucleic Acid |
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| RPN3001 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 1899.6 EUR |
Ecl Direct Nucleic Acid |
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| RPN3005 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 834 EUR |
EZCell? Direct Glucose Uptake Assay Kit |
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| K924-50 | Biovision | each | 888 EUR |
Direct Blue 199 (C.I. 74190) |
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| GT1468-100G | Glentham Life Sciences | 100 g | 237.6 EUR |
Direct Blue 199 (C.I. 74190) |
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| GT1468-10G | Glentham Life Sciences | 10 g | 74.4 EUR |
Direct Blue 199 (C.I. 74190) |
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| GT1468-25G | Glentham Life Sciences | 25 g | 103.2 EUR |
Direct Blue 199 (C.I. 74190) |
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| GT1468-10 | Glentham Life Sciences | 10 | 31.7 EUR |
Direct Blue 199 (C.I. 74190) |
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| GT1468-100 | Glentham Life Sciences | 100 | 166 EUR |
Direct Blue 199 (C.I. 74190) |
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| GT1468-25 | Glentham Life Sciences | 25 | 55.4 EUR |
Direct PCRKits for Blood |
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| FYT302-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
Direct PCRKits for Plant |
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| FYT303-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
Human Mumps IgG ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7073 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Mumps IgM ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7074 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Cyclic AMP Direct ELISA Kit (1 Plate) |
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| K019-H1 | Arbor Assays | 1x96 well plate | 395 EUR |
Cyclic AMP Direct ELISA Kit (5 Plate) |
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| K019-H5 | Arbor Assays | 5x96 well plate | 1557 EUR |
Cyclic GMP Direct ELISA Kit (1 Plate) |
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| K020-H1 | Arbor Assays | 1x96 well plate | 407 EUR |
Cyclic GMP Direct ELISA Kit (5 Plate) |
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| K020-H5 | Arbor Assays | 5x96 well plate | 1593 EUR |
Direct Yellow 50 (C.I. 29025) |
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| GT5274-100G | Glentham Life Sciences | 100 g | 144 EUR |
Direct Yellow 50 (C.I. 29025) |
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| GT5274-25G | Glentham Life Sciences | 25 g | 79.2 EUR |
Direct Yellow 50 (C.I. 29025) |
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| GT5274-100 | Glentham Life Sciences | 100 | 89.3 EUR |
Direct Yellow 50 (C.I. 29025) |
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| GT5274-25 | Glentham Life Sciences | 25 | 35.5 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
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| 105-540 | GeneOn | 20 rcs x 50 µl | 196.8 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
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| 105-542 | GeneOn | 100 rcs x 50 µl | 658.8 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
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| 105-544 | GeneOn | 1000 rcs x 50 µl | 5026.8 EUR |
ANA IgG Screening ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7016 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Rubella IgG ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7082 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Rubella IgM ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7083 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Direct-Q½ 3 UV Remote |
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| ZRQSVR300 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 7656.04 EUR |
Direct-Q½ 5 UV Remote |
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| ZRQSVR500 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 8143.03 EUR |
Direct-Q½ 8 UV Remote |
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| ZRQSVR800 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 8286.64 EUR |
FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions |
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| 4615 | Intact Genomics | 1/EA | 621.6 EUR |
Human Brucella IgG ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7021 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Brucella IgM ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7022 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human HSV-1 IgG ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7058 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human HSV-1 IgM ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7059 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human HSV-2 IgG ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7060 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human HSV-2 IgM ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7061 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Toxoplasma IgG ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7099 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Toxoplasma IgA ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7100 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Toxoplasma IgM ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7101 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Cardiolipin IgG ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7024 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Cardiolipin IgA ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7025 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Human Cardiolipin IgM ELISA Kit (Direct EIA) |
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| EK7026 | BosterBio | 96wells/kit, with removable strips. | 573.6 EUR |
Direct Cyclic GMP (cGMP) ELISA Kit (1 Plate) |
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| K065-H1 | Arbor Assays | 1x96 well plate | 407 EUR |
Direct Cyclic GMP (cGMP) ELISA Kit (5 Plate) |
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| K065-H5 | Arbor Assays | 5x96 well plate | 1593 EUR |
Alkphos Direct Labelling Reagents |
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| RPN3680 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 813.6 EUR |
Alkphos Direct Hybridisation Buffer |
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| RPN3688 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 770.4 EUR |
Bei der dCAPS-
Technik wird die Restriktionsstelle innerhalb des interessierenden SNP entweder eingeführt oder zerstört, indem ein PCR-Primer mit einer oder mehreren Fehlpaarungen mit der Ziel-DNA verwendet wird. Die Genotypisierung von Arabidopsis-Pflanzenindividuen wurde mit der dCAPS-Technik direkt aus Blattstanzen durchgeführt. Die amplifizierten Produkte wurden verdaut und die resultierenden Fragmente, die den Genotyp jedes Individuums enthüllten, wurden durch Gelelektrophorese analysiert