• Mai 21, 2022

Humane Phosphoserinaminotransferase 1 (PSAT1)

Abstrakt
Hintergrund/Ziele: Phosphoserin-Aminotransferase 1 (PSAT1) wird in vielen Karzinomgeweben überexprimiert, jedoch ist wenig über ihre Expression und Funktion bei der Karzinogenese des Ösophagus bekannt. Diese Studie untersuchte die Expression von PSAT1 in Geweben des menschlichen Plattenepithelkarzinoms des Ösophagus (ESCC), um die Beziehung zwischen PSAT1-Expression und klinisch-pathologischen Faktoren zu bestimmen.

Methoden: Die Expression von PSAT1 in 64 chirurgischen Resektionen von Ösophagus-Karzinogenese-Patienten wurde durch quantitative RT-PCR und Immunhistochemie untersucht und die Ergebnisse wurden mit klinisch-pathologischen Faktoren verglichen. In-vitro-Experimente wurden in ESCC-Zellen durchgeführt, die PSAT1 überexprimieren, um die Zelllebensfähigkeit und -invasion zu messen. Die Tumorbildung in vivo wurde durch subkutane Injektion von Tumorzellen in immungeschwächte Mäuse untersucht.

Ergebnisse: Die PSAT1-Expression war in ESCC-Geweben im Vergleich zu normalen Ösophagusgeweben erhöht. Eine erhöhte PSAT1-Expression war signifikant mit dem Krankheitsstadium, Lymphknotenmetastasen, Fernmetastasen und einer schlechten Prognose assoziiert. In vitro förderte PSAT1-Überexpression die ESCC-Zellproliferation und Matrigel-Invasion. In vivo verstärkte die Injektion von PSAT1-überexprimierenden ECSS-Zellen in Mäuse die Tumorbildung. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass PSAT1 die Expression und/oder Aktivität von GSK3β/Snail hochregulierte. Schlussfolgerung: PSAT1 spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von ESCC und sagt ein schlechtes Überleben voraus. Daher könnte PSAT1 ein vielversprechendes neues therapeutisches Ziel gegen Krebs sein.

Einführung

Speiseröhrenkrebs ist eine besonders aggressive bösartige Erkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate. Es ist weltweit die achthäufigste Krebsart und die sechsthäufigste krebsbedingte Todesursache [1,2,3,4]. Diese Art von Krebs ist bei Männern etwa viermal häufiger als bei Frauen, und es gibt sehr unterschiedliche Häufigkeiten zwischen den Ländern, wobei China etwa die Hälfte aller Fälle ausmacht [5,6]. Es gibt zwei Hauptursachen für Speiseröhrenkrebs, das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) und das Adenokarzinom des Ösophagus (EAC). ESCC stammt von Epithelzellen, die die Speiseröhre auskleiden, während EAC aus Drüsenzellen im unteren Drittel der Speiseröhre entsteht. ESCC ist die vorherrschende Ursache für Speiseröhrenkrebs und für etwa 60–70 % aller Fälle von Speiseröhrenkrebs weltweit verantwortlich, während EAC 20–30 % ausmacht, und eine Reihe weniger häufiger Arten auftreten. Die Inzidenz von EAC nimmt jedoch stetig zu [7,8]. Jeder Faktor, der chronische Reizungen und Entzündungen verursacht, erhöht das ESCC-Risiko, und Tabak- und Alkoholkonsum gelten daher als die primären Risikofaktoren für ESCC [9,10]. Im Gegensatz dazu ist Adipositas häufig mit EAC verbunden, und die erhöhte Prävalenz von Adipositas entspricht der erhöhten Inzidenz von EAC [11,12]. Die Behandlung richtet sich nach dem Stadium und dem Ort des Krebses, und die klinischen Ergebnisse hängen vom Ausmaß der Erkrankung ab, sind jedoch im Allgemeinen schlecht, da die Diagnose bei dieser Krebsart oft spät erfolgt.

  • Der Metabolismus von Serin und Glycin spielt eine wichtige Rolle bei der Zellproliferation, da diese Aminosäuren wesentliche Vorläufer für die Makromolekülsynthese und wichtig für die Aufrechterhaltung des zellulären Redoxzustands sind.
  • In den letzten Jahren wurde eine Hyperaktivierung des Serin/Glycin-Stoffwechselwegs mit der Krebsentstehung in Verbindung gebracht [13]. Es wurde vermutet, dass die selektive Expression einiger metabolischer Enzyme als prognostischer Faktor für Krebs fungiert [14].
  • Serin wird über eine dreistufige Reaktion synthetisiert: (1) die Umwandlung von 3-Phosphoglycerat in 3-Phosphohydroxypuruvat, katalysiert durch Phosphoglyceratdehydrogenase (PHGDH), (2) die Umwandlung von 3-Phosphohydroxypuruvat in Phosphoserin durch das Enzym Phosphoserinphosphatase (PSPH). ) und (3) die Umwandlung von Phosphoserin in Serin durch Phosphoserinaminotransferase (PSAT1).
  • Es wurde gezeigt, dass das Enzym, das den ersten Schritt im Serin-Biosyntheseweg katalysiert, PHGDH, einen prognostischen Wert bei der Vorhersage des Überlebens von Patienten in Bezug auf Brustkrebs, aber nicht auf Lungenkrebs hat, was darauf hinweist, dass andere Mechanismen bei anderen Krebsarten, möglicherweise anderen, eingesetzt werden können Enzyme des Serinstoffwechsels [14].
  • Es wurde gezeigt, dass PSAT1 die Zellproliferation und Chemoresistenz in vitro fördert [15,16] und dieses Enzym wurde eng mit der Tumorentstehung bei Dickdarmkrebs, Brustkrebs und nicht-kleinzelligem Lungenkrebs in Verbindung gebracht, indem es den Zellzyklus reguliert [17,18,19 ,20]. Es gibt Hinweise darauf, dass PSAT1 während der Karzinogenese als proproliferativer und überlebensfördernder Faktor fungieren könnte. Noch weniger ist über die Expression und den zugrunde liegenden Mechanismus bekannt, durch den PSAT1 zur ESCC-Entwicklung und -Progression beiträgt.

Unsere früheren Studien ergaben, dass PSAT1 als direktes Ziel von miR-340 zum Fortschreiten und zur Invasivität von ESCC beitragen kann [21]. In dieser Studie analysieren wir die Rolle von PSAT1 bei der Entwicklung von ESCC und untersuchen die Beziehung zwischen PSAT1-Expression und klinisch-pathologischen Faktoren, einschließlich der Patientenprognose. Zusammengenommen identifizieren unsere Daten PSAT1 als potenzielles neues therapeutisches Ziel bei Speiseröhrenkrebs.

Materialen und Methoden

Patienten und Gewebeproben

Patienten, die für diese Studie ausgewählt wurden, wurden von 2004 bis 2007 im Tongren Hospital mit ESCC diagnostiziert und vor der Verabreichung einer Chemotherapie einer Speiseröhrenkrebsresektion unterzogen. ESCC und Karzinom-benachbarte Gewebe wurden unmittelbar nach der chirurgischen Resektion gesammelt und von erfahrenen Pathologen bestätigt. Alle Proben wurden in der Gewebebank des Tongren-Krankenhauses der Shanghai Jiaotong University School of Medicine hinterlegt und gemäß den lokalen ethischen Richtlinien (wie in der Deklaration von Helsinki festgelegt) anonym kodiert. Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung nach Aufklärung eingeholt, und das Protokoll wurde vom Review Board der Shanghai Jiaotong University School of Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer: 20120614-XF). ESCC-Proben wurden gemäß den Klassifikationsrichtlinien des American Joint Cancer Committee/Union Internationale Contre le Cancer (UICC/AJCC) eingeteilt. Die Einstufung und histopathologische Subtypisierung von ESCC-Proben basierte auf den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation. Vierundsechzig ESCC-Biopsieproben und ihre angrenzenden passenden nicht krebsartigen Ösophagusgewebe wurden manuell präpariert, um Bindegewebe zu entfernen, und wurden dann sofort bis zur weiteren Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Zelllinien und Kulturbedingungen

Eine unsterblich gemachte humane Ösophagus-Plattenepithelzelllinie (HET-1A) wurde von einer Kultursammlung amerikanischen Typs erworben und in RPMI-1640-Medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Gibco), gezüchtet. Menschliche embryonale HEK293T-Nierenzellen und drei ESCC-Zelllinien (EC1, EC109, EC9706) wurden von der Chinese Academy of Medical Science (Shanghai, China) erworben und routinemäßig in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) oder RPMI-1640-Medium (Gibco ) ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 µg/ml Streptomyc bei 37 °C in befeuchteter Luft mit 5 % CO2.

Quantitative Echtzeit-PCR

Die gesamte zelluläre RNA wurde aus Zellen unter Verwendung von Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. RNA wurde mit RNase-freiem Wasser eluiert, bei einer Extinktion bei 260/280 nm quantifiziert und für die reverse Transkription verwendet. cDNA wurde durch Oligo(dT)-Priming unter Verwendung des RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, ON, Kanada) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Quantitative Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung eines kommerziellen SYBR-Green-Master-Mix-Kits (Takara, Tokyo, Japan) und eines Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. GAPDH wurde als interne Kontrolle mitgeführt. Jede Probe wurde dreifach gemessen. Primer und Sonden für die quantitative Echtzeit-PCR wurden von Applied Biosystems erworben. Die Primersequenzen für PSAT1 waren F: 5′-GGCCAGTTCAGTGCTGTCC-3′ und R: 5′-GCTCCTGTCACCACATAGTCA-3′, und für GAPDH waren F: 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′ und R: 5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′.

Plasmidkonstrukte und lentivirale Transduktion

Um den lentiviralen Vektor pCDH-PSAT1 zu erzeugen, der PSAT1 überexprimiert, wurde die vollständige codierende Sequenz durch PCR aus HEK293T-Zell-cDNA amplifiziert und dann in die BamHI/EcoRI-Stellen des pCDH-CMV-EF1-copGFP-Vektors (SBI, Mountain View, CA , USA) unter Verwendung der folgenden Primer: Vorwärtsprimer, 5′-AAAGAATTCATGGACGCCCCCAGGCAG-3′; Reverse-Primer: 5′-AAAGGATCCTCATAGCTGATGCATCTCCAAAA AT-3′. Die korrekten Insertionen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.oder der Produktion viraler Partikel wurde das Lentivirus-vermittelte PSAT1-Verpackungssystem, enthaltend pCDH-CMV-EF1-copGFP oder pCDH-PSAT1, mit Rec, TAT, Gag und Vsvg in HEK293T-Zellen mit Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kotransfiziert Anweisungen. Der die Virusquelle enthaltende Überstand wurde 60 h nach der Transfektion gesammelt und durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 &mgr;m (Millipore, Bedford, MA, USA) geleitet.

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Antibody (FITC)

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (Psat1) Antibody (FITC)

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (Psat1) Antibody (FITC)

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CLIA Kit for Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1)

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Antibody (Biotin)

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PSAT1 (untagged)-Human phosphoserine aminotransferase 1 (PSAT1), transcript variant 1

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Mouse Phosphoserine aminotransferase, Psat1 ELISA KIT

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Polyclonal Antibody

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Polyclonal Antibody to Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1)

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Polyclonal Antibody (Human, Mouse, Pig)

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Psat1 (untagged) - Mouse phosphoserine aminotransferase 1 (Psat1), transcript variant 2

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Polyclonal Antibody (Human, Mouse, Pig), PE

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Polyclonal Antibody (Human, Mouse, Pig), APC

4-PAD861Hu01-APC Cloud-Clone
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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Polyclonal Antibody (Human, Mouse, Pig), Cy3

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Polyclonal Antibody (Human, Mouse, Pig), FITC

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Polyclonal Antibody (Human, Mouse, Pig), HRP

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Psat1 ELISA Kit| Mouse Phosphoserine aminotransferase ELISA Kit

EF015876 Lifescience Market 96 Tests 826.8 EUR

Psat1 (Myc-DDK-tagged) - Mouse phosphoserine aminotransferase 1 (Psat1), transcript variant 1

MR205716 Origene Technologies GmbH 10 µg Ask for price

Rabbit Polyclonal antibody to PSAT1 (phosphoserine aminotransferase 1)

TA307984 Origene Technologies GmbH 100 µl Ask for price

Psat1 (myc-DDK-tagged) - Mouse phosphoserine aminotransferase 1 (Psat1), transcript variant 2

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Phosphoserine Aminotransferase 1 (PSAT1) Polyclonal Antibody (Human, Mouse, Pig), APC-Cy7

4-PAD861Hu01-APC-Cy7 Cloud-Clone
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Die Zellen wurden in der log-Phase gezüchtet und dann entweder mit pCDH-CMV-EF1-copGFP (Vektor) oder pCDH-PSAT1 für 24 h transfiziert. Stabile Zelllinien wurden durch Massensortierung auf einem FACSAria-Durchflusszytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) basierend auf der Expression von GFP, das von dem lentiviralen Vektor 72 h nach der Transfektion getragen wird, gescreent.

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